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前言 多药耐药(multidrug resistance，MDR)是导致人类恶性肿瘤化疗失败的主要原因。MDR的分子学机制有很多，主要有以下几种：(1)将化疗药物从细胞内泵出的膜转运蛋白的激活，其中主要包括MDR1编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和多药耐药相关蛋白(multidrug-resistance associated protein，MRP)；(2)谷胱甘肽解毒系统酶类的激活(主要为GST-π)；(3)调控凋亡基因的突变(特别是p53和Bcl-2)。MDR相关基因在大部分的人类肿瘤中表达，它们在不同癌组织的表达与联合化疗的不敏感性相关。有研究表明多数肿瘤在治疗前通常MDR1表达很低或观察不到，而化疗后其表达增加。肿瘤细胞在化疗药物的短期诱导下，可出现MDR1的mRNA表达的增加。 促分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)的信号传导途径，是细胞生长和分化的重要环节。Ras／Raf-1／MEK1／2／ERK1／2，即ERK1／2信号传导通路，是MAPK众多通路中的一个。肿瘤细胞在化疗药物作用下，出现MDR1表达增加的同时，也发现了MAPKs活性的增加。有研究表明，通过MEK抑制剂PD098059在耐药细胞株L1210／VCR作用下，显著逆转其耐药性，准确的作用机制尚未明了。MAPK是否参与细胞的多药耐药以及通过MEK的调节能否引起MDR表达的改变还需要进一步深入研究。 近来的研究发现，P-gp的功能与蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)有关。PKC是一族结构相近的同工酶，广泛参与细胞信号传递、调节细胞增殖及分化，肿瘤的发生及发展、癌基因激活，蛋白质磷酸化和细胞对生长因子的应答等多种生理、生化及病理过程。研究发现，有些P-gp过表达的MDR肿瘤细胞的PKC活性明显高于其敏感细胞，但Schwartz等报告人急性淋巴细胞白血病耐药株MOLT-3／TQ2500的PKC活性却低于其敏感细胞株。在人类白血病及一些实体瘤细胞中PKC抑制剂可降低P-gp磷酸化，部分逆转耐药细胞的耐药性，而在人急性淋巴细胞白血病细胞MOLT-3中，PKC激活剂及抑制剂均未能使其耐药细胞的耐药性发生改变。另外，也有报告，PKC磷酸化P一gP对P一gP泵功能无调节作用，抑制PKC逆转耐药与诱导细胞凋亡有关。 本实验采用长春新碱(vincristine，VCR)在短期内对胃癌细胞株MGC803的作用，观察其MDR相关基因表达的变化。并通过特异性MEKI/2抑制剂PDo98059及特异性PKCa、p抑制剂myr一中PKC，观察其对MDR的影响。材料与方法 一、细胞培养 人胃癌细胞系MGC803细胞，生长于含有56℃、30分钟灭活后的10%的胎牛血清和12U/血庆大霉素的RpMll640培养液中，在37℃、5%CoZ、饱和湿度培养箱内传代培养。 二、细胞形态学分析 用VCR(20n岁ml)或VCR(20n扩ml)+PDO98059(1 on竹耐)、vCR(20n岁血)+myr一中PKC(50nM/ml)作用于MGC803细胞24h，48h后，制成细胞涂片，瑞氏一姬姆萨染色巧一20min，光学显微镜下观察细胞形态。 三、细胞周期解析 将Meeso3细胞调整浓度至一x一05个/d，接种于12孔板，每孔Ilnl。分别加人vCR(20n酬rnl)、P〕为8059(10nM/Inl)、VCR(20ng/ml)+PDC98059(10nM/ml)、m”一中PKC(SOnM/耐)及VCR(20n扩Inl)+myr-中pKC(50nM/Inl)，于24，48，96小时收集细胞，收集的细胞以冷PBS，120x95分钟，离心洗涤2次加人体积比为70%的冷乙醇4℃过夜，PBs，120 xg5分钟洗涤2次，加人Rnase(200卜岁血)37℃1小时，加人PI(20林岁mI)4℃闭光染色30分钟后进行流式细胞仪解析，用SSC和邓C两个参数选取细胞，用PI荧光测pNA含量，采用CELLQuest软件进行细胞周期分析。 四、MTr法检测药物的敏感性 VCR(20n岁Inl)刺激72h的MGC8o3细胞以1 x 10，个/Inl的浓度将细胞接种于96孔板，在培养箱中培养4h，待细胞贴壁后，分成三个实验组，一组加人不同浓度的VCR(In岁ml，10n扩ml，100n扩rnl，1000n扩Inl);一组加人PD098059(10nM/ml)后，加人不同浓度的VCR(In扩nil，10ng/ml，loon扩耐，l000n扩d);另一组加人myr一中PKC(50nwd)后，加人不同浓度的VCR(In扩Inl，10n留Inl，100ng/Inl，1000n扩Inl)。同时以未用VCR预先刺激的MGC803细胞加人不同浓度VCR(In扩rnl，10n『Inl，100n岁ml，l000n扩耐)为阴性对照组。细胞继续培养72h，在培养结束前4个小时，每孔加人20闪(sm『时)M竹，4小时后吸出50泌液体，加人150衅二甲基亚矾(DMSO)，混匀后，在酶标仪中用570lun的波长检测细胞的OD值。通过不同浓度的OD值得出各实验组的Ic50。 五、Western blot 将MGC803细胞用VCR(20n扩Inl)或VCR(20n扩Inl)+PD098059(Ion柑ml)、vCR(20n扩ml)+m打一中pKC(50nM/mI)分别作用24、48、72h后，收集细胞，将总数在 2 x 107个细胞裂解于含有100林扩祖蛋白酶抑制剂PMSF，2卜g/d Aprotinin的RIPA裂解液中，冰浴下超声粉碎，4℃裂解40分钟，4℃15400转，离心20分钟。取上清，定蛋白浓度。取100林g蛋白，90V恒定电压使滨酚蓝染料从3%的浓缩胶进人5%的分离胶后，以120V恒定电压电泳至适当位置后，将蛋白转印至PvDF，5%脱脂奶粉封闭，加人兔抗人P一gP、MRPI多克隆抗体及鼠抗