论文部分内容阅读
媒介传播的疾病占所有传染病的17%。蚊作为重要的传播媒介,可以传播多种严重的蚊媒病,如疟疾、登革热、寨卡、脑膜脑炎等。目前,蚊媒病缺乏有效的疫苗和治疗药物,迫切需要有效的方法来控制蚊媒,其中化学防制因其快速高效、使用方便等优点,广泛用于蚊媒控制。随着杀虫剂大规模、持续使用,蚊媒对其产生抗药性并持续发展,成为媒介控制的主要障碍。蚊媒抗药性成为亟待解决的问题。深入了解抗药性的调控机制才能科学有效的治理媒介抗药性。目前,代谢抗性是公认的、最重要的、研究最为广泛的抗药性机制,其中细胞色素P450与抗药性的研究是近年来的热点。MicroRNAs(miRNA)能够与基因messenger RNA(mRNA)“靶位点”结合,参与基因转录后调控,影响生物体内的相关调控进程。基于本实验室前期淡色库蚊miRNA高通量测序数据,我们使用miRDeep预测方法预测新miRNA。选择miRDeep预测分析得分相对较高的9个miRNA,使用定量PCR检测它们在淡色库蚊溴氰菊酯敏感(DS-strain)和抗性品系(DR-strain)中的相对表达水平。结果显示,新miRNA(miR-13664)在DS-strain中高表达。miR-13664的种子域能与CYP314A1的3’端非编码区(3’UTR)互补配对,提示miR-13664可能调控CYP314A1的表达。通过Argonaute干涉实验验证新miR-13664是否为miRNA;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证miR-13664和CYP314A1的表达量;体外双荧光素酶报告系统和基因显微注射技术鉴定miR-13664和CYP314A1之间的调控关系;基因显微注射的方式将miR-13664高表达或抑制其表达,观察蚊对溴氰菊酯敏感性的变化,并干涉CYP314A1的表达观察蚊对溴氰菊酯敏感性的变化。本研究主要结果如下:1.Argonaute 1(Ago1)参与miRNA生物合成途径,而Argonaute 3(Ago3)参与piRNA生物合成途径。分别应用Ago1和Ago3干涉实验敲低淡色库蚊的相关基因表达后,我们发现与NC对照组相比,敲低Ago1蚊miR-13664的表达量降低约38%(P<0.01),而Ago3的敲低对miR-13664表达没有影响,表明Ago1对于本研究中鉴定的新miRNA(miR-13664)的生物合成是必需的。2.靶标预测结果提示,miR-13664的种子域序列与致倦库蚊CYP302A1、CYP307B1、CYP314A1的3’端非编码区(3’UTR)互补配对。采用qRT-PCR,对miR-13664、CYP302A1、CYP307B1和CYP314A1在DS-strain和DR-strain间的表达量进行检测。定量结果表明,miR-13664在DS-strain中的表达量是DR-strain的1.92倍(P<0.001),CYP314A1和CYP302A1在DR-strain的表达量分别是DS-strain的2.34倍(P<0.001)、1.58倍(P<0.05),CYP307B1的表达量差异无统计学意义。后期测序发现miR-13664与淡色库蚊CYP314A1的3’端非编码区(3’UTR)完全互补配对,而CYP302A1 3’端非编码区(3’UTR)与种子域不能完全互补配对。提示miR-13664可能调节CYP314A1的表达。3.双荧光素酶报告结果表明,与NC对照组相比,miR-13664 mimic可使转染了CYP314A1质粒的荧光素酶的荧光读值降低37%(P<0.01),证实了miR-13664可在体外调控CYP314A1的表达。在蚊体内,基因显微注射敲低miR-13664,CYP314A1的表达升高1.71倍(P<0.01);而过表达miR-13664,CYP314A1的表达降低了48%(P<0.001),进一步验证了miR-13664可在体内调控CYP314A1的表达。以上结果表明,miR-13664可以调控CYP314A1的表达。4.通过显微注射将miR-13664 inhibitor注入DS-strain蚊体内,qRT-PCR结果显示注射miR-13664 inhibitor蚊体内miR-13664表达量比NC对照组降低了70%(P<0.001);CDC bottle bioassay发现,注射miR-13664 inhibitor可使蚊对溴氰菊酯敏感性降低,死亡率明显低于对照组。相反将miR-13664 mimic注入DR-strain蚊体内,qRT-PCR结果显示注射miR-13664 mimic蚊体内miR-13664表达量是NC对照组的约15倍(P<0.001)。CDC bottle bioassay发现,注射miR-13664 mimic可使蚊对溴氰菊酯敏感性增高,死亡率明显高于对照组。结果表明,miR-13664参与蚊抗药性的形成。5.将DR-strain蚊的CYP314A1敲低,qRT-PCR结果显示敲低组CYP314A1的表达量比NC对照组降低了约59%(P<0.01)。CDC bottle bioassay发现,干涉CYP314A1可使蚊对溴氰菊酯敏感性增高,死亡率明显高于对照组。结果表明,CYP314A1与蚊抗药性相关。本研究报告了,淡色库蚊新miRNA(miR-13664)参与蚊抗药性的形成,其通过调控靶基因CYP314A1的表达参与调控蚊抗药性。本研究进一步揭示了蚊抗药性形成的潜在分子机制,为蚊媒综合治理提供了科学依据。