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本文主要研究mi RNAs对成肌细胞分化的影响,探索mi RNAs调控成肌细胞的分化和肌肉形成的分子机理,以及成肌细胞分化和成肌细胞凋亡之间的联系。在以往对mi R-449a研究中,我们发现mi R-449a主要作用是通过抑制一些控制细胞增殖的基因来使细胞周期停止,从而促进细胞的凋亡和分化。mi R-449a关于成肌细胞分化和凋亡影响的研究却很少,有研究表明在mdx小鼠中检测到mi R-449a的表达量下降,但对其没有做更深一步的研究。因此,在这里我们着重研究mi R-449a对C2C12小鼠成肌细胞分化和凋亡的影响。本文通过生物网站获得mi R-449a的成熟序列合成mi R-449a mimics和mi R-449a inhibitor,分别将它们转染到C2C12成肌细胞中来增加细胞内mi R-449a和减少细胞内源的mi R-449a;收集细胞通过QPCR和Western blotting来检测mi R-449a对C2C12成肌细胞分化的标记基因的影响。研究结果如下:1.mi R-449a的生物信息学分析通过人和小鼠对比发现人体的mi R-449a与小鼠的mi R-449a序列完全一样,这说明mi R-449a在人和小鼠之间保守性高。在mi RNAs靶基因预测数据库中,获得几个mi R-449a的潜在靶基因。它们分别是Hdac1基因、Cdc25a基因、Cdk6基因和Bcl2基因都存在与mi R-449a结合的序列。2.mi R-449a以及相关基因在C2C12成肌细胞分化过程中表达量的分析我们通过对C2C12成肌细胞分化零天、第二天、第三天和第五天进行QPCR检测,发现mir-449a在分化过程中不断升高,分化第二天、第三天和第五与零天相比差异显著;并且我们对Cdk6、Cdc25a、Hdac1、Bcl2和E2F1等五个基因也进行了定量检测,结果发下前四个基因在C2C12成肌细胞分化过程中表达量降低且差异显著,而Bcl2基因的表达量差异不显著但有下降的趋势。3.转染mi R-449a mimics对C2C12成肌细胞分化影响的分析在这一过程中,我们完成了Hdac1基因的3’UTR载体以及突变载体的构建。转染mi R-449a mimics时,检测荧光发现3’UTR载体荧光活性与突变载体的荧光活性差异不显著。在转染mi R-449amimics过程中,我们对Hdac1基因进行了QPCR和western blotting检测发现Hdac1基因的m RNA和蛋白水平都没有明显变化,这说明在小鼠Hdac1基因不是mi R-449a的靶基因。在这里我们对mi R-449a的预测靶基因Cdk6基因和Cdc25a基因进行了定量检测,发现在超表达mi R-449a使Cdk6基因和Cdc25a基因两个基因的m RNA表达水平下降且差异显著(P<0.01),这说明mi R-449a能有效抑制Cdc25a基因和Cdk6基因的m RNA的表达。另外,我们对控制细胞增殖的转录因子E2F1基因也进行了定量检测结果发现转录因子E2F1基因的m RNA表达量也下调且差异显著(P<0.05)。这就说明mi R-449a可能是同过靶定Cdk6基因和Cdc25a基因抑制它们的表达从而阻碍E2F1基因的表达。我们对预测靶基因Bcl2基因也进行了QPCR检测和western blotting蛋白检测,结果发现超表达mi R-449a时,Bcl2基因的m RNA水平显著下降(P<0.05),Bcl2基因的蛋白表达也明显下降,这就说明mi R-449a可能靶定上Bcl2基因。在这里我们完成了肌肉分化标记基因的检测,首先我们对MHC(myosion heavy chain)蛋白进行了western blotting实验,发现转染mi R-449a mimics能有效促进MHC蛋白的表达;但是有兴趣的是我们western blotting检测Myog基因蛋白时,发现其蛋白变化差异不显著;同时我们对Myod基因和Myomaker基因进行定量检测,发现这两个基因的m RNA的表达水平差异不显著。这说明mi R-449a可以通过其他方式来调控C2C12成肌细胞的分化过程。为了进一步研究mi R-449a是如何影响C2C12成肌细胞分化,我们在超表达mi R-449a时对肌肉分化也其调节作用的另外两个基因Caspase-3基因和P21基因进行了western blotting检测,发现转染mi R-449a mimics促进Caspase-3基因和P21基因蛋白的表达。4.转染mi R-449a inhibitor对C2C12成肌细胞分化影响的分析在C2C12成肌细胞转染mi R-449a inhibitor后,我们对mi R-449a的预测靶基因Hdac1基因、Cdc25a基因、Cdk6基因和Bcl2基因以及控制C2C12成肌细胞分化的标记基因Myomaker基因进行了定量检测,结果发现Cdc25a基因和Cdk6基因的m RNA表达水平明显下降(P<0.05)。Hdac1基因和Myomaker基因的m RNA的表达量与超表达mi R-449a时的结果一样差异不明显,这就进一步说明mi R-449a很可能通过靶定Cdc25a基因和Cdk6基因对C2C12成肌细胞的分化过程起调控作用。