马氏珠母贝生长相关基因筛选与功能验证

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本研究以马氏珠母贝杂交家系(B与C)和近交家系(A与D)为实验材料进行RNA-seq测序,结合已有生长性状QTLs数据,筛选生长相关基因,进行候选基因锌脂蛋白1(PmOSR1),β-微管蛋白4B(PmTubB-4B),G蛋白偶联受体84(PmGPCR-84)与核受体亚家族5(PmNR5A2)特性分析,对PmOSR1,Pmβ-4B与PmEGFR基因进行SNP标记以及生长指标关联分析,筛选优异基因型,具体结果如下:1、本研究利用BGISEQ-500平台共检测8个样品,每个家系2个平行样,平均每个样品获得6.6Gb数据,以[log2 Ratio(BP/SP)]>1 and FDR<=0.001来筛选显著差异基因,杂交家系B与近交家系A,D相比有79个显著性差异基因,42个上调,37个下调;杂交家系C与近交家系A,D相比有68个基因,其中49个上调,19个下调;2、结合生长性状QTLs数据与转录组数据,筛选4个生长候选基因(PmOSR1,PmTubB-4B,PmGPCR-84与PmNR5A2),利用cDNA末端快速扩增技术获得候选基因全长,其中,PmOSR1全长1732bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长951bp,编码317个氨基酸,5′非翻译区(5′UTR)长107bp,3′非翻译区(3′UTR)长674bp;PmTubB-4B全长1634bp,ORF长1338bp,编码446个氨基酸,5′UTR长91bp,3′UTR长205bp;PmGPCR-84全长1332bp,ORF长1032bp,编码344个氨基酸,5′UTR长192bp,3′UTR长108bp;PmNR5A2全长2223bp,ORF长993bp,编码331个氨基酸,5′UTR长176bp,3′UTR长1054bp;qRT-PCR结果表明,PmOSR1,PmTubB-4B和PmNR5A2基因在鳃组织中表达量最高,PmGPCR-84基因在肝胰腺和鳃中表达量最低。3、运用目标重测序法对PmOSR1,PmTubB-4B和PmEGFR基因进行SNP分型。结果发现:PmOSR1有45个SNP位点,其中8个同义突变;PmTubB-4B有85个SNP位点,其中14个同义突变;PmEGFR有144个SNP位点,其中48个同义突变,1个非同义突变。四引物突变受阻体系法对3个基因的一个SNP位点进行分型,结果与重测序结果一致。4、对检测到SNP位点进行哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)分析,结果显示:PmOSR1基因有28个SNP位点符合HWE平衡,PmTubB-4B基因有31个SNP位点符合HWE平衡,PmEGFR基因有83个SNP位点符合HWE平衡(P>0.05)。与生长指标进行关联分析,PmOSR1有4个位点与生长性状显著相关(P<0.05);PmTubB-4B有14个位点与生长形状显著相关(P<0.05);PmEGFR有31个位点与生长显著相关(P<0.05)。5、将与生长显著相关SNP位点进行单倍型分析,PmOSR1有1个block,3个单倍型,AGT为优异单倍型;PmTubB-4B有2个block,4个单倍型,CG为优异单倍型;PmEGFR有3个block,6个单倍型,第二个block中CGG和第三个block中GT为优异单倍型。
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