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犬细小病毒病(Canine parvovirus disease,CPVD)是上世纪七八十年代所发现的急性传染病,是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)感染所诱发的,临床上主要有出血性肠炎型和心肌炎型2种。该病传播速度快,发病率和死亡率高,四季均可发生,以春夏居多,给犬业发展造成了巨大的危害,因此,快速、准确的诊断对CPVD的防治至关重要。本研究旨在建立CPV双抗体夹心ELISA检测和胶体金免疫层析试纸条检测方法,并尝试将生物素-亲和素系统的信号放大作用应用到胶体金免疫层析试纸条上,以提高试纸条检测的灵敏度,为临床快速准确检测和诊断CPV提供依据。本研究包括以下3个部分内容:一、犬细小病毒单克隆抗体ELISA检测法的建立将实验室制备的4株单克隆抗体进行两两配对,选取读值最高的一对,即包被单克隆抗体3A5(mAb-3A5),用辣根过氧化物酶(HRP)标记mAb-3A5作为酶标二抗建立单克隆抗体夹心ELISA检测法以检测CPV抗原。优化试验的反应条件:mAb-3A5的最佳包被浓度为4μg/mL,4 ℃被过夜,最佳封闭条件为10%胎牛血清PBS(含0.05%Tween-20)于37。℃孵育2 h,CPV最佳孵育条件为37 ℃作用1 h,检测抗体HRP-3A5的最佳稀释度为1:2000。所建立的ELISA检测法特异性试验表明,该法与F81细胞上清、犬腺病毒1型(CAV-1)、犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCV)均不发生阳性反应;敏感性试验表明该法可检测到的CPV含量最低限度为102TCID50/mL;重复性试验所获批内和批间变异系数分别为2.7%～6.5%和1%～5%。用该法同PCR法同时检测52份临床样品,结果具有高度一致性,符和率达100%。说明本试验建立的单克隆抗体ELISA检测法可用于CPV的临床检测。二、犬细小病毒单克隆抗体免疫层析试纸条制备在已建立的CPV单克隆抗体夹心ELISA方法的基础上,用胶体金标记纯化的mAb-3A5,捕获CPV抗原,将纯化的mAb-3A5作为检测抗体,羊抗鼠IgG抗体作为质控抗体,分别包被于硝酸纤维素膜(NC膜)制备犬细小病毒胶体金免疫层析试纸条。反应条件优化试验表明,胶体金标记mAb-3A5的最佳pH为8.0,能使胶体金稳定的最佳抗体浓度为18μ/mL,用含5%蔗糖的Tris缓冲液重悬金标抗体,确定NC膜上检测抗体和质控抗体的工作浓度分别为1.0和2.0mg/mL,并用1%的脱脂奶粉对NC膜进行封闭。特异性试验表明,该试纸条与常见的犬易感的其他病毒,如犬冠状病毒等均不发生阳性反应;该法能检测到的CPV含量最低限度为102TCID50/mL,说明其有较好的敏感性;重复性试验也证明该试纸条具有良好的可重复性。用该法与所建立的单克隆抗体夹心ELISA法同时检测52份临床样品,结果符合率高达98%。说明本试验制备的胶体金免疫层析试纸条可用于CPV的临床检测。三、生物素-亲和素在胶体金免疫层析试纸条上的应用在已建立的CPV免疫层析试纸条的基础上,将生物素-亲和素系统(BAS)的信号放大作用应用到试纸条上,用胶体金标记链霉亲和素制备胶体金垫,将纯化的mAb-3A5和羊抗鼠IgG分别作为检测抗体和质控抗体固定到硝酸纤维素膜上制备试纸条,检测时将生物素-抗体复合物与样品进行混合点样。结果表明已成功将生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BNHS)标记到抗体,胶体金标记到链霉亲和素,但制备试纸条还需进一步优化生物素标记抗体及胶体金标记亲和素的方法,检测线、质控线抗体的包被以及生物素-抗体与待检样品混合方式等,所以真正将此信号放大作用应用到试纸条上尚需进一步的试验。