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目的:牵张成骨（Distraction osteogenesis,DO）是一种利用骨创伤愈合机制快速生成新骨的内源性骨组织工程学技术,其成骨效率可达青少年快速发育期骨生长速度的4至6倍。本课题组前期对犬下颌骨牵张区骨组织及犬下颌骨骨折区骨组织进行了第二代全基因组高通量测序,发现转录激活因子4（activating transcription factor 4,ATF4）的表达量在牵张组显著高于骨折组,我们推测ATF4对DO过程中的快速成骨起关键作用。在施加牵张力后,牵张间隙所处的持续低氧微环境会作为一种刺激触发内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS）,激活PERK/eIF2α/ATF4信号通路,从而参与骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的成骨分化。此研究首先验证了ATF4、HIF-1α等在牵张及骨折动物模型中的表达,而后用低氧小室模拟低氧微环境培养犬BMSCs,研究适宜程度的低氧对BMSCs内质网应激及成骨分化的影响,分析PERK/eIF2α/ATF4信号通路在BMSCs成骨分化中的作用,进一步阐明DO快速成骨的分子机制,为其临床应用提供更加完善的理论基础。方法:1、动物模型及犬BMSCs低氧模型的建立与低氧微环境对犬BMSCs的影响:首先构建犬下颌骨牵张成骨及骨折动物模型,qRT-PCR检测犬下颌骨牵张区组织与骨折区组织中HIF-1α,PERK,eIF2α,ATF4,OCN,BSP的表达。应用密度梯度离心法对犬BMSCs进行分离及体外培养,通过流式细胞仪对犬BMSCs进行鉴定,茜素红染色实验检测犬BMSCs的成骨能力,Transwell实验检测犬BMSCs的迁移能力;CCK-8实验检测低氧微环境下犬BMSCs增殖能力的变化;茜素红实验检测低氧微环境对犬BMSCs成骨能力的影响;Transwell实验检测低氧微环境对犬BMSCs迁移能力的影响;qRT-PCR检测低氧微环境对犬BMSCs中HIF-1α,PERK,eIF2α,ATF4,OCN,BSP基因表达的影响;Western Blot检测低氧微环境对犬BMSCs中HIF-1α,t-PERK,p-PERK,t-eIF2α,p-eIF2α,ATF4,OCN,BSP蛋白表达的影响。2、ATF4对犬BMSCs的影响及其与PERK/eIF2α/ATF4信号通路的关系:构建沉默ATF4的犬BMSCs模型;CCK-8检测沉默ATF4对低氧微环境下犬BMSCs增殖能力的影响;茜素红实验检测沉默ATF4对低氧微环境下犬BMSCs成骨能力的影响;Transwell实验检测沉默ATF4对低氧微环境下犬BMSCs迁移能力的影响;qRT-PCR检测沉默ATF4对低氧微环境下犬BMSCs中HIF-1α,PERK,eIF2α,ATF4,OCN,BSP基因表达的影响;Western Blot检测沉默ATF4对低氧环境下犬BMSCs中HIF-1α,t-PERK,p-PERK,teIF2α,p-eIF2α,ATF4,OCN,BSP蛋白表达的的影响。结果:1、动物模型及犬BMSCs低氧模型的建立与低氧微环境对犬BMSCs的影响:成功构建动物模型,qRT-PCR结果显示牵张区组织中HIF-1α,PERK,eIF2α,ATF4,OCN,BSP的表达明显高于骨折区组织（P＜0.001）。CCK-8实验显示低氧微环境下犬BMSCs的增殖能力较常氧下高（P＜0.01）;茜素红实验显示低氧微环境可促进犬BMSCs的成骨分化（P＜0.01）;Transwell实验显示低氧微环境可以促进犬BMSCs的迁移（P＜0.001）;qRTPCR结果显示低氧微环境促进犬BMSCs中HIF-1α,PERK,eIF2α,ATF4,OCN,BSP基因的表达（P＜0.001）;Western Blot结果显示低氧微环境促进犬BMSCs中HIF-1α,t-PERK,p-PERK,t-eIF2α,p-eIF2α,ATF4,OCN,BSP的蛋白表达（P＜0.001）。2、ATF4对犬BMSCs的影响及其与PERK/eIF2α/ATF4信号通路的关系:CCK-8实验显示沉默ATF4抑制犬BMSCs的增殖能力,低氧后增殖能力有所回复（P＜0.05）;茜素红实验显示沉默ATF4抑制犬BMSCs的成骨能力,低氧后增殖能力有所回复（P＜0.001）;Transwell实验显示沉默ATF4抑制犬BMSCs的迁移能力,低氧后迁移能力有所回复（P＜0.001）;qRT-PCR结果提示si-NC-Hyp组中HIF-1α,PERK,eIF2α,ATF4,OCN,BSP的相对m RNA表达量较si-NC组均显著升高（P＜0.001）;si-ATF4组中HIF-1α、PERK与eIF2α的相对m RNA表达量较si-NC组无显著差异（P＞0.05）;而ATF4、OCN与BSP的相对m RNA表达量在si-ATF4组中较si-NC组显著降低（P＜0.001）,在si-ATF4-Hyp组中又有所回复（P＜0.05）;Western Blot结果显示si-NC-Hyp组中HIF-1α,t-PERK,p-PERK,t-eIF2α,peIF2α,ATF4,OCN,BSP的相对蛋白表达量较si-NC组均显著升高（P＜0.001）;si-ATF4组中HIF-1α、t-PERK、p-PERK、t-eIF2α与p-eIF2α,的相对蛋白表达量较si-NC组无显著差异（P＞0.05）;而ATF4、OCN与BSP的相对蛋白表达量在si-ATF4组中较si-NC组显著降低（P＜0.001）,在si-ATF4-Hyp组中又有所回复（P＜0.001）。结论:1、牵张区组织处于低氧微环境中,内质网应激及成骨相关因子在牵张区组织中表达增高。低氧微环境促进犬BMSCs的增殖、成骨、迁移及内质网应激相关因子与成骨相关因子的表达,在一定程度上触发内质网应激,激活PERK/eIF2α/ATF4信号通路;2、ATF4沉默抑制了犬BMSCs的增殖、成骨及迁移,而低氧微环境促进犬BMSCs的增殖、成骨及迁移,PERK/eIF2α/ATF4信号通路在其中起到了至关重要的作用。