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苏云金芽胞杆菌是一种低GC含量,既能产生芽胞又能产生杀虫晶体蛋白的革兰氏阳性细菌,在自然界中分布范围广。芽胞形成和杀虫晶体蛋白的调控机制一直是苏云金芽胞杆菌的研究热点。目前,人们对芽胞形成的机制有了比较深入的了解,对杀虫晶体蛋白的形成机制也有了一定的认识,但是关于Cry2类杀虫晶体蛋白代谢的调控机制研究仍不完善。转录调控蛋白CodY在低GC含量的革兰氏阳性菌中具有全局性的转录调控作用,在枯草芽胞杆菌中可调控超过200个基因的表达,这些基因与细胞感受态的形成、物质代谢、能量代谢以及病原微生物的毒力都有相关性。CodY蛋白在模式菌株枯草芽胞杆菌中的研究比较透彻,但在苏云金芽胞杆菌中则几乎是个空白。本实验室之前研究表明：CodY蛋白过表达能够引起苏云金芽胞杆菌YBT-881沉默的杀虫晶体蛋白基因cry2Ac4的表达,因此,CodY在杀虫晶体蛋白的形成过程中扮演着极其重要的作用。本研究在苏云金芽胞杆菌YBT-1520全基因组测序完成的基础之上,寻找与鉴定CodY蛋白作用的靶基因,从而为杀虫晶体蛋白形成的机制作进一步的补充,并为构建苏云金芽胞杆菌的代谢调控网络打下一定的基础。1.根据已经测得的YBT-1520全基因序列,我们对codY基因进行了生物信息学分析,Blast分析表明它与腊状芽胞杆菌的核苷酸序列相似性在99%以上,但相对于模式菌株枯草芽胞杆菌而言,相似性只有75%左右,序列相似性差异还是比较大的。另外,我们还对codY基因在YBT-1520中的位置进行了生物信息学的分析与预测,发现codY基因位于一个由7个ORF组成的操纵子中。2.本实验通过构建一种体外的Pull down方法在YBT-1520全基因组范围内寻找CodY蛋白调控的靶基因,用生物素-链霉亲和素系统亲和纯化与靶基因结合的CodY蛋白,ELISA和Western blot实验证明CodY-Ap蛋白能在体外生物素化,表明构建的该方法是可行的。3.通过生物素pull down的方法我们分析得到46种CodY蛋白直接作用的靶基因,分类后,发现这些靶基因涉及物质运输、代谢、环境信号的感知、遗传信息的传递等。我们选取5种可能与晶体蛋白形成相关的基因片段作进一步的验证,这其中既有位于启动子区域的DNA片段,也有位于基因内部的DNA片段。应用细菌单杂交系统进行验证,结果表明其中4种基因ilvB, oppA, yhfE, luxS与CodY蛋白有相互作用,这些基因与氨基酸转运、蛋白降解、支链氨基酸合成等相关,进而会影响杀虫晶体蛋白的形成。