研究背景自二十世纪初期,就有学者开始尝试动物肾移植, Ullmann和Decastello在1902年成功地完成了同种动物肾移植。1954年,世界第1例同卵双生兄弟间的肾移植手术,获得成功,开启了肾移植的新纪元,在二十一世纪最初十年,就有从5万人左右上升到近10万人在美国器官分享联合网(UNOS)上注册等待接受肾移植,且逐年攀升。我国吴阶平院士,在1960年最先进行了首例人体肾移植。到1970年末,肾移植作为治疗尿毒症的一种有效手段在大城市逐渐推广。历经一个多世纪的发展,肾移植作为治疗终末期肾脏疾病方法,已是首选。正是由于新型免疫抑制剂的大力研发,加之组织配型技术的成熟,才使得肾移植获得了举世瞩目的成就。但急性排斥反应(acute rejection, AR)仍是肾移植患者术后经常面临的最常见风险之一。AR的发生相当程度上影响了人肾的长期存活率及生活质量,所以,AR的早期诊断和治疗就显得刻不容缓。临床上目前诊断AR,主要从临床特征、血生化指标变化如血肌酐值升高、尿量减少、体重增加、发热,伴或不伴蛋白尿、血尿等现象,但往往是出现在移植肾已有病理改变之后,传统方法尚不能预警诊断AR。在欧美,能及时发现AR得益于临床上程序性活检开展良好,但因其不属于无创性检查,且可能出现并发症,我国患者普遍不能接受。国内外有研究者利用的血、尿标记物如Perfori fractalkine、GB、IP21、FOXP3、PI等诊断AR,但其敏感性、特异性不高。彩色多普勒通过评价移植肾血流灌注来判断急性排斥反应,但是,慢性排斥反应、免疫抑制剂中毒、移植肾动脉狭窄等术后并发症同样会出现阻力指数(RI)等血流参数的变化。MR扩散加权成像(DWI)检查由于其可以评价早期移植肾血流灌注,或许能作为监测移植肾急性排斥反应的一种无创性检查,但是肾脏表观扩散系数(apparent diffusion coefficient, ADC) ADC值波动较大.因此还需深入研究。MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约18～25个核苷酸,具有高度的保守性、时序性和组织特异性,是调控基因表达的关键因子,广泛参与了机体的各种的调节途径,包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等,miRNAs效应分子参与了免疫反应的各个阶段,与T、B细胞的分化发育及B细胞抗体的类别转换密切相关,具有免疫调控的作用。miRNAs与AR的发生有着紧密联系。南方医科大学珠江医院器官移植科2009级硕士研究生课题中提出在小鼠皮肤移植急性排斥反应中miR-142-5p、miR-155存在着过高的表达。Anglicheau et al.研究发现在肾移植急性排斥反应患者的肾穿组织与正常移植肾比较,niRNA-let-7c, miRNA-10a, miRNA-10b, miRNA-125a, miRNA-200a, miRNA-30a-3p, miRNA-30b, miRNA-30c, miRNA-30e-3p and miRNA-32表达下调,而上调表达的有miRNA-142-5p, miRNA-142-3p, miRNA-155,miRNA-223, miRNA-146b, miRNA-146a, and miRNa-342。Sui W et al等研究发现,肾移植术后发生急性排斥反应的患者,miRNA-324-23p, miRNA-611, miRNA-330,miRNA-524, miRNA-17-3p, miRNA-483, miRNA-663, miRNA-516-5p,miRNA-326, miRNA-197and miRNA-346表达下调,miRNA-658, miRNA-125a, miRNA-320, miRNA-381,miRNA-628, miRNA-602, miRNA-629and miRNA-125a表达上调。Putta et al等在小鼠实验中发现miRNA-192通过降低胶原蛋白、TGF-p和纤维连接蛋白的表达进而减慢肾纤维化的进程。Zhou等发现狼疮病人合并肾损害尿中miR-27b、miR-192高表达。由此可见,MiRNAs参与了肾移植术后患者排斥反应及移植肾纤维化的疾病演变过程中,所以,我们通过构建不同大鼠肾移植模型,并检测血液中miR-192、miR-320和miR-223的变化,来探讨其是否对急性排斥反应的发生起到预警诊断的作用。根据国内外大鼠肾移植模型文献报道,我们选择Wistar-SD作为供受体研究所需的大鼠肾移植模型,并通过检测不同大鼠移植模型中miRNAs的变化,来探索寻找无创检测AR的特异性生物学标记物。目的1.建立大鼠肾移植模型。2.探讨血液中miRNAs在大鼠肾移植模型的表达水平变化。方法建立大鼠肾移植模型1)动物分组实验分两组；Wistar大鼠为供者,SD大鼠为受者建立同种异体基因移植组(急性排斥反应组)。Wistar大鼠为供者,SD大鼠为受者术后给予环孢素A(CsA)免疫抑制(术后第1天起,CsA按2mg/kg腹腔注射、1次/天)建立同种异体基因移植免疫抑制组(正常肾移植组),每组10对。2)肾移植1%戊巴比妥钠注射麻醉后,采用原位低温肝素钠灌注切取供体左肾,受体于原位在显微外科操作下肾动脉端端吻合、肾静脉硬膜外导管支架端端吻合、输尿管端端吻合大鼠肾移植手术。3)术后观察预实验后期,两组大鼠肾移植术后第1、3、5、7天,取出移植肾,浸入10%中性福尔马林,切片并进行HE染色进行病理检查。正式实验期间,每天观察摄食、饮水、尿量等一般生存情况及大鼠齿龈、皮毛、活动等个体状况。尿量>5mL/d,手术成功,尿量<1mL/d,需行活检明确病因。探讨血液中miRNAs在不同大鼠肾移植模型的表达水平变化1)动物分组：实验分两组；Wistar大鼠为供者,SD大鼠为受者建立同种异体基因移植组(急性排斥反应组)。Wistar大鼠为供者,SD大鼠为受者术后给予环孢素A(CsA)免疫抑制(术后第1天起,CsA按2mg／kg腹腔注射、1次／天)建立同种异体基因移植免疫抑制组(正常肾移植组),每组10对。2)肾移植：1%戊巴比妥钠注射麻醉后,采用原位低温肝素钠灌注切取供体左肾,受体于原位在显微外科操作下肾动脉端端吻合、肾静脉硬膜外导管支架端端吻合、输尿管端端吻合大鼠肾移植手术。3)血液中miRNAs的检测：两组分别于术前(day0)、术后第一天(day1)、术后第三天(day3)、术后第五天(day5)、第七天(day7)断尾采血2mL,血液样本采用EDTA抗凝,-80℃保存。采用miRNA提取试剂盒提取RNA,行逆转录反应,然后采用荧光定量PCR法检测mir-192、mir-320及mir-223的表达量。根据样本扩增曲线图和融解曲线图,测量荧光信号达到设定的阈值所经过的循环次数(Ct值),所得数据采用2-ΔΔCt法进行分析。统计学方法采用SPSS13.0对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示。单因素的组间比较采用单向方差分析,重复测量数据的组间比较采用重复测量数据的方差分析,析因设计资料的组间比较采用析因设计资料的方差分析,多重比较时若满足方差齐性采用Bonferroni法,若方差不齐采用Dunnett’s T3法。以P<0.05为差异有统计学差异。结果1.两组大鼠存活状况及并发症预实验共用50对大鼠,其中Wistar、SD大鼠分别为50只,用于练习制作大鼠肾移植模型,在预实验期间,受者都常规在术后3天予以结扎右肾动脉造成右肾缺血坏死,观察14天,记录大鼠存活状况以及各种术后并发症发生情况,(见表1)。练习了显微技能及模型制作,于3个月后,开始正式实验,正式实验大鼠共20对,其中Wistar、SD大鼠分别为20只(非实验设计死亡的大鼠均依据实验要求再补充完整),记录大鼠存活状况以及各种术后并发症发生情况,(其中死亡大鼠指非按实验计划处死的大鼠)(见表1)。在正式实验阶段,供体手术1-1.5h,受体肾移植血管吻合总时间(30±3)min,输尿管吻合时间(12±2),手术时间1.5-2h。2.两组大鼠肾组织病理学观察正常肾移植组肾脏外观和光镜下组织观察基本正常,急性排斥组移植肾外观苍白肿胀,光镜下肾间质呈弥漫性水肿,淋巴细胞和单核细胞多灶状或弥漫性浸润,并侵入肾小管管壁出现肾小管炎,部分肾小球内可见单个核细胞和中性粒细胞浸润。急性排斥组大鼠术后1、3、5、7d组织病理学诊断均有AR。两组大鼠不同时间血液中三种miRNA的变化不同组间mir-192的相对表达水平有显著性差异(F=23.153,P=0.000)；不同时间之间的mir-192的相对表达水平亦有显著性差异(F=24.019,P=0.000)；组别与时间之间的交互效应显著(F=13.639,P=0.000)。在术后第五天(day5),两组间mir-192的相对表达水平有显著性差异(F=19.490,P=0.002),急性排斥组较正常肾移植组显著升高(P=0.002)。不同组间mir-320的相对表达水平有显著性差异(F=16.925,P=Q.001)；不同时间之间的mir-320的相对表达水平亦有显著性差异(F=13.334,P=0.000)；组别与时间之间的交互效应不显著(F=2.978,P=0.128)。在术后第五天(day5),两组间mir-320的相对表达水平有显著性差异(F=10.172,P=0.020)。不同组间mir-223的相对表达水平无显著性差异(F=1.279,P=0.360)；不同时间之间的mir-223的相对表达水平有显著性差异(F=13.987,P=0.000)；组别与时间之间的交互效应不显著(F=0.479,P=0.870)。结论1. Wistar为供者,SD为受者,采用肾动脉端端吻合、静脉硬膜外导管支架吻合、输尿管端端吻合能建立稳定的肾移植急性排斥反应模型。2.大鼠血液中mir-192和mir-320在肾移植急性排斥反应早期表达升高,可以用于大鼠急性排斥反应的早期预测。3.大鼠血液中mir-223在肾移植急性排斥反应早期未有明显升高,不能用于大鼠急性排斥反应的早期预测。