微孢子虫（Microsporidia）是广泛分布于自然界的真菌类、细胞内专性寄生的真核微生物,具有广泛的宿主,包括无脊椎动物和脊椎动物。近10年来由于艾滋病患者后期临床治疗问题,加速了病原微孢子虫致病侵染机制、诊断和药物设计的研究。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）最早发现于1857年,是专性寄生于经济昆虫家蚕的病原微生物,它所引发的家蚕微粒子病给世界养蚕业造成巨大危害,包括中国、印度和泰国等。揭示家蚕微孢子虫的侵染机制,攻克微粒子病这一蚕丝业的顽症,一直是世界蚕业界的重点和难点研究领域。微孢子虫的孢壁主要由蛋白质和几丁质构成,对孢壁蛋白的鉴定和功能研究是揭示微孢子虫侵染机制的主要方向。因孢壁结构的特殊性和研究手段的局限性,有效分离和鉴定孢壁蛋白的工作相当困难,其相应的功能研究进展缓慢。迄今为止,国内外已鉴定的微孢子虫孢壁蛋白仅有11个,其中兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi）4个,小肠脑炎微孢子虫（Encephalitozoon intestinalis）2个,而家蚕微孢子虫仅5个。有关微孢子虫孢壁蛋白功能的研究报道更为鲜见,已报道的孢壁蛋白仅发现孢壁蛋白Enp1或SWP26能介导孢子对宿主细胞的粘附,HSWP5能保护孢子免于宿主细胞的吞噬。除了孢壁以外,微孢子虫的极管在孢子侵染宿主中也发挥着关键性作用。微孢子虫在适当外界信号刺激下会迅速弹出极管并刺入宿主细胞,将感染性孢原质通过极管注入宿主细胞质,完成其生活史。极管主要由3种蛋白PTP1、PTP2和PTP3组成,它们之间相互作用共同构建极管。本研究在家蚕微孢子虫孢壁蛋白前期研究的基础上,结合家蚕微孢子虫的全基因组数据鉴定和分析了家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP5。采用原核表达、抗体制备、Southern-blot、Western-blot、RT-PCR、间接免疫荧光、免疫电镜等技术,分析和鉴定了SWP5基因在染色体上的分布,以及SWP5蛋白的表达和亚细胞定位特征。通过间接免疫荧光、免疫共沉淀和质谱鉴定等技术,对SWP5及其相互作用的靶蛋白进行了鉴定。进一步采用抗体封闭抑制实验,探讨了家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP5与孢子发芽,以及孢子对宿主的侵染能力之间的关系。主要研究结果如下：1.家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP5编码基因的生物信息学特征序列分析结果显示,SWP5计算分子量为20.30kDa,理论等电点为4.54。SWP5蛋白序列除含1个信号肽外,仅有一些磷酸化位点和糖基化位点,不具备任何已知的功能结构域单元,也无跨膜域或GPI锚定位点。SWP5蛋白结构简单,仅有少量α螺旋和β折叠,不具有已知的功能结构域和活性位点。SWP5蛋白仅与同属蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）的1个Unkown蛋白具有较低序列相似性（登录号XP₀02996352.1；Identity25%）,与其它任何已报道物种的基因无同源性。SWP5与已报道微孢子虫家族基因无任何在基因座位上保守的Synteny共线性关系。SWP5与已报道的孢壁蛋白无同源性,在家蚕微孢子虫自身基因组内也没有非拷贝型同源性蛋白。综上,家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP5是一种高特异性的蛋白,为家蚕微孢子虫所特有。SWP5蛋白可以作为一种专门针对家蚕微孢子虫的高特异性检测靶标。2.家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP5基因的染色体定位和转录分析为了鉴定孢壁蛋白SWP5编码基因在家蚕微孢子虫染色体上的定位情况,本研究利用生物信息学和Southern blot技术对SWP5基因进行了鉴定。序列分析结果表明,SWP5基因在基因组中还存在另一个拷贝（GenBank accession numbers:HQ881497）。Southern blot分析结果显示,有2条不同的染色体区域显著地被SWP5特异性探针所杂交,从实验上证实了SWP5在家蚕微孢子虫全基因组中存在2个拷贝。为了调查孢子入侵家蚕后孢壁蛋白SWP5编码基因在孢子不同发育时期的表达情况,收集了感染孢子后第1-10天的家蚕中肠组织,提取RNA并反转录获得cDNA,采用SWP5基因特异性引物进行RT-PCR,结果发现SWP5基因在入侵家蚕后24h无转录活性。随着孢子发育进程的继续,从第2天起直至第10天,均能检测到SWP5基因的转录活性。以上数据表明,SWP5蛋白可能自母孢子到成熟孢子时期就已表达并参与了孢壁的构建。3.家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP5的原核表达和抗体检测为了鉴定SWP5蛋白,我们克隆了其编码基因（GenBank accession number:EF683105）。PCR扩增片段和表达载体p-ColdⅠ经EcoRⅠ和Sal Ⅰ酶切后连接,获得重组质粒,转化进大肠杆菌（E.coli Rosetta Gami）进行诱导表达。表达的重组蛋白SWP5-pCold I经镍柱纯化后,注射小鼠制备了anti-SWP5多克隆抗体。Western blot检测发现,在家蚕微孢子虫孢子总蛋白中出现了单一的杂交信号条带,说明SWP5多克隆抗体制备成功。4.SWP5的免疫定位分析亚细胞定位预测SWP5蛋白为细胞壁型蛋白。我们利用anti-SWP5抗血清分别通过Western blot、IFA和IEM技术,对SWP5在孢子的亚细胞定位特征进行了分析。Western blot分析发现anti-SWP5抗血清能特异性的识别孢壳上的蛋白,说明该抗原蛋白即为SWP5,获得了SWP5蛋白在孢壳上的初步定位特征信息。为了探明SWP5定位在孢壳的外壁还是内壁,我们分别用正常的和经SDS处理的孢子进行间接免疫荧光定位分析。发现未经SDS处理的孢子能被anti-SWP5抗血清特异地识别并呈现明亮的绿色荧光信号,而经SDS去除孢壁表面蛋白的孢子未能被anti-SWP5抗血清特异地识别,说明孢壁蛋白SWP5定位在孢壁的外表面。为了进一步确定SWP5在孢子中的精细定位情况,采用免疫胶体金透射电镜技术对孢壁蛋白在整个孢子中的定位特征进行了调查。发现孢壁蛋白SWP5不仅定位在孢壁的外表面,而且定位于孢壁内侧的极管区域,但在孢内壁和孢壁的几丁质层未见分布。综上,我们用不同的手段从不同的角度充分证实了SWP5确实为家蚕微孢子虫孢壁的蛋白质组成成份,该蛋白参与了孢壁的构建。5.孢壁蛋白SWP5的互作靶蛋白的鉴定为了进一步认识孢壁蛋白SWP5在家蚕微孢子虫中扮演的角色,通过寻找孢壁蛋白SWP5的互作靶蛋白,探讨了SWP5与靶蛋白之间的生物学关联。以K2CO3诱导孢子发芽和玻璃珠破碎孢子提取的总蛋白为背景,Anti-SWP5鼠抗血清为猎饵进行免疫共沉淀试验。结果显示,捕获的猎物蛋白中出现2条明显的差异带,表观分子量分别为31和150kDa左右。进一步通过LC-MS/MS质谱鉴定,这2个蛋白分别为家蚕微孢子虫的极管蛋白PTP2和PTP3。此外,将已发芽的孢子用anti-SWP5抗血清处理后进行间接免疫荧光分析,发现已发芽孢子的极管呈现明亮的绿色荧光信号,表明孢壁蛋白SWP5能与极管发生相互作用。综上,免疫共沉淀、质谱和间接免疫荧光分析结果表明,家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP5与组成极管的蛋白PTP2和PTP3存在相互作用的关系,极管可能与孢壁存在相互作用的关系。6.孢壁蛋白SWP5在孢子极管弹出和孢子对宿主侵染中的作用为了探索家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP5在孢子发芽和孢子对宿主侵染中的作用,我们将纯化的孢子经anti-SWP5抗血清孵育后,一方面经K2CO3诱导发芽后计算极管的弹出率,另一方面饲喂家蚕幼虫,统计家蚕幼虫的死亡率。结果发现：Anti-SWP5抗血清处理组的极管弹出率显著（P<0.001）低于PBS和鼠阴性血清处理组。鼠阴性血清和anti-SWP5各处理组孢子发芽率的平均值分别为50.6%、35.4%和36.0%,统计结果表明孢子在碱性条件下能弹出极管,孢子经anti-SWP5抗血清处理后其极管弹出率相对下降了30%。家蚕幼虫摄食经anti-SWP5抗血清处理的孢子后,第6-10天家蚕存活率显著高于阴性血清对照组（P<0.001）。综上数据,孢壁蛋白SWP5在孢子对宿主的侵染中扮演了重要的角色,但仍需更确凿数据的证实。