论文部分内容阅读
目的根据前期试验结果,我们假设：在真核细胞生物中广泛存在蛋白丝氨酸乙酰化,而钙调蛋白激酶-2β (CaMk2β)是丝氨酸乙酰化重要目标蛋白之一。本研究确认CaMk2β蛋白丝氨酸乙酰化修饰,探讨CaMk2β蛋白丝氨酸乙酰化修饰对该蛋白激酶功能的影响。方法1.确认真核细胞中内源CaMk2β蛋白的丝氨酸乙酰化：根据肾脏透明细胞癌及癌旁组织中可能存在丝氨酸乙酰化的前期实验结果,提取293T细胞的总蛋白,用免疫沉淀技术纯化出CaMk2β型蛋白,SDS-PAGE电泳分离纯化后的蛋白,经过胶内酶解处理,液-质连用质谱技术(LC-MS/MS)对酶解后的CaMk2β蛋白肽段进行氨基酸乙酰化修饰分析,确定所有氨基酸乙酰化修饰位点,了解CaMk2β蛋白丝氨酸乙酰化修饰在功能区的分布状态。2.确认外源CaMk2β蛋白在原核细胞中的丝氨酸乙酰化：①构建PQE-His30-CaMk2β重组质粒：提取293T细胞总RNA,运用RT-PCR反转录技术扩增目的基因片段,目的基因片段和空载质粒双酶切、连接、转化,构建重组质粒。运用invitrogen公司测序技术检测重组质粒碱基序列。②外源性CaMk2β在原核细胞中的表达：通过IPTG诱导剂使外源性CaMk2β质粒在原核细胞中表达。③LC-MS/MS技术检测原核细胞中表达CaMk2β蛋白丝氨酸乙酰化修饰：CaMk2β重组质粒在原核细胞中表达后,将纯化后的CaMk2β蛋白和293T细胞全蛋白孵育1h,同时没有孵育的CaMk2β蛋白作对照,检测这两者CaMk2β蛋白丝氨酸乙酰化修饰。3.确认外源CaMk2β蛋白在真核细胞中的丝氨酸乙酰化：①构建PCDNA-Flag3.0-CaMk2β重组质粒：以PQE-His30-CaMk2β重组质粒为模板,PCR扩增后的产物和PQE His30空载通过双酶切,连接构建重组质粒。运用invitrogen公司测序技术检测重组质粒碱基序列。②检测CaMk2β蛋白的表达：通过转染技术把质粒转入293T细胞,40h左右收细胞,提取细胞全蛋白,Western Bloting技术检测重组质粒的表达。③用免疫沉淀法(Immunoprecipitation, IP)纯化外源性CaMk2β蛋白及LC-MS/MS技术对丝氨酸乙酰化修饰进行相对定量分析：用免疫沉淀法纯化外源性CaMk2β蛋白,SDS-PAGE分离蛋白,从SDS-PAGE胶上切下相应的CaMk2β蛋白所对应的条带,进行质谱上样前的酶解和质谱分析,并运用ProteomeDiscover1.3软件对CaMk2β蛋白丝氨酸上乙酰化修饰进行相对定量。④免疫印迹技术(Western blotting)检测CaMk2β蛋白丝氨酸乙酰化修饰：通过天津的三箭公司合成针对所有丝氨酸乙酰化修饰的广谱抗体,Western blotting检测CaMk2β蛋白丝氨酸乙酰化修饰。4.确认CaMk2β蛋白的丝氨酸乙酰化修饰对功能的影响：①构建PCDNA-Flag3.0-CaMk2β突变质粒及检测该突变质粒的表达：以PCDNA-Flag3.0-CaMk2为模板,合成引物(包含突变位点),该突变位点是把CaMk2β蛋白276位上的丝氨酸分别突变成丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C),然后转染细胞,IP-WB技术检测突变质粒的表达。②检测CaMk2β蛋白激酶276位丝氨酸乙酰化修饰对CaMk2β蛋白激酶287位苏氨酸乙酰化修饰的影响：IP-WB技术检测CaMk2β蛋白激酶丝氨酸276位发生突变后是否影响CaMk2β蛋白287位点磷酸化。结果1.真核细胞中内源CaMk2β蛋白存在广泛的丝氨酸乙酰化位点：LC-MS/MS分析293T中CaMk2β蛋白发现大量丝氨酸位点都发生乙酰化修饰,并且丝氨酸乙酰化修饰主要集中调节结构域和亚基间相互作用结构域。2.外源CaMk2β蛋白在原核细胞中也存在广泛的丝氨酸乙酰化位点：①通过酶切鉴定和invitrogen公司测序技术检测PQE30-His-CaMk2β重组质粒重组质粒碱基序列正确。②IPTG诱导PQE30-His-CaMk2β重组质粒在BL21原核细胞中成功表达。③原核细胞表达的外源性CaMk2β蛋白丝氨酸乙酰化分析：CaMk2β重组质粒在原核细胞中成功表达后,将纯化后蛋白和293T细胞全蛋白孵育后,发现CaMk2β蛋白大量丝氨酸位点发生乙酰化修饰,然而直接检测纯化后的CaMk2β蛋白发现,该蛋白大量丝氨酸位点也可以发生乙酰化修饰。3.外源CaMk2β蛋白在真核细胞中存在广泛丝氨酸乙酰化位点：①运用酶切鉴定和invitrogen公司测序技术检测PCDNA-Flag3.0-CaMk2β重组质粒碱基序列完全正确。②免疫印迹技术(Western blotting)检测PCDNA-Flag3.0CaMk2β重组质粒表达成功。③IP技术纯化外源性CaMk2β蛋白,该蛋白质谱上样前酶解,Proteome Discover1.3搜库软件对蛋白激酶丝氨酸乙酰化修饰进行相对定量分析,检测出各个丝氨酸位点乙酰化修饰占该位点检测的总量的百分比如下：S51占11%、S71占16.7%、S235占17.7%、S276占41.8%、S280占42.5%、S315占47.8%、S327占49.0%、S331占38.2%、S343占37.0%、S362占18.2%、S367占11.1%、S451占2%、S456占7%、S494占1.8%、S504占1.7%、S513占8.5%、S522占13%、S533占22%.④通过天津三箭公司合成的针对丝氨酸上的乙酰化抗体,检测到外源性CaMk2β蛋白的丝氨酸确实发生乙酰化修饰。4CaMk2β蛋白的丝氨酸乙酰化影响该蛋白287位点磷酸化：①通过invitrogen公司测序技术检测重组突变质粒碱基序列完全正确,重组突变质粒转染293T细胞后,wB检测该重组突变质粒表达正确。②IP-WB技术检测276位丝氨酸乙酰化对CaMk2β蛋白酶的活性有影响,突变成丙氨酸后能够降低CaMk2β蛋白287位点磷酸化,也既是降低该酶的活性,突变成天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)增强CaMk2β蛋白287位点磷酸化,而287位点苏氨酸磷酸影响该激酶的活性。结论1.证实了真核细胞中CaMk2β蛋白存在广泛丝氨酸乙酰化位点。2.证实了原核细胞中CaMk2β蛋白存在广泛丝氨酸乙酰化位点。3.CaMk2β的多个丝氨酸位点被乙酰化修饰,以前证实这些乙酰化修饰位点可以发生磷酸化修饰,揭示了丝氨酸乙酰化和磷酸化可能存在竞争关系。4.CaMk2β276位丝氨酸乙酰化和磷酸化修饰可能影响该蛋白287位苏氨酸磷酸化,参与调节CaMk2β蛋白激酶的激活过程。创新及意义普遍认为乙酰化修饰主要发生在赖氨酸上,而丝氨酸主要发生磷酸化修饰。已知丝氨酸和苏氨酸磷酸化在细胞周期、凋亡、增殖及信号转导过程中起重要的作用,所以当丝氨酸和苏氨酸被乙酰化,它将在这些功能中发挥重要作用。本实验通过LC-MS/MS和免疫技术首先发现真核生物和原核生物中普遍存在乙酰基转移反应活性,使CaMk2β蛋白丝氨酸发生广泛乙酰化修饰。值得强调的是,乙酰化修的饰位点已被证明发生磷酸化修饰。我们结果显示：丝氨酸乙酰化和磷酸化修饰可能存在竞争关系,参与调节CaMk2β蛋白的激活过程,这个发现对了解CaMk2β在生物体中的功能具有重要的意义。