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流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae,Hi)根据有无荚膜分为荚膜型和无荚膜型,无荚膜型又称不可分型(non-typeable Haemophilus influenzae,NTHi),NTHi定居在人类鼻咽部,常引起内源性继发感染,导致脑膜炎、肺炎、鼻窦炎、中耳炎、呼吸道感染、败血症等多种疾病,已成为临床感染中重要的常见条件致病菌。其中因NTHi引起全球两大高发疾病—儿童中耳炎(otitis media,OM)和成人慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的急性加重而备受关注,因此,迫切需要开发有效的疫苗预防NTHi感染。经研究发现,NTHi外膜蛋白在其感染致病和与宿主细胞相互作用中发挥着重要作用,可引起宿主的保护性免疫,被列为NTHi候选疫苗靶抗原,而其中外膜蛋白P6保守性较高,成为国内外学者研究的焦点。鼻黏膜免疫是预防NTHi呼吸道感染的有效免疫途径,但单纯的P6蛋白引起的免疫反应较弱,因此,尚需有效的载体和佐剂增强其免疫效果。壳聚糖微球因其粘附性、高渗透性以及可被黏膜M细胞吞噬等特点被作为黏膜免疫途径的蛋白和核酸转运载体。另外,随着抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)靶向技术的发展,甘露糖受体(mannose receptor,MR)已用于各种疫苗的递送系统中。本研究用甘露糖修饰的壳聚糖微球负载P6蛋白,通过壳聚糖微球的蛋白转运功能和甘露糖靶向MR介导的内吞作用,提高APC的抗原摄取效率,从而增强P6蛋白的免疫效果。从菌株NTHi ATCC49247提取DNA,以其为模板经PCR扩增获得P6蛋白基因,核苷酸序列长度为462 bp。利用生物信息学分析其核苷酸同源性为99.17%～100%,其编码氨基酸同源性为96.18%～100%,蛋白质二级结构以α螺旋和β转角为主,为亲水性蛋白。用PCR扩增的P6基因构建重组质粒PGEX-6p2/P6,经原核表达系统获得重组蛋白GST-P6,Pre Scission蛋白酶去除标签GST,得到分子量为16k Da的P6蛋白。在氰基硼氢化钠的催化下,将甘露糖的羟基与壳聚糖游离氨基连接,获得甘露糖修饰的壳聚糖衍生物,茚三酮比色法测得壳聚糖游离氨基的取代度为18.75%。通过离子交联法制备壳聚糖微球(CMs)和甘露糖修饰的壳聚糖微球(MCMs),并将P6蛋白负载于微球载体上制备壳聚糖微球疫苗(P6-CMs)和甘露糖修饰壳聚糖的微球疫苗(P6-MCMs),BCA方法检测每毫升CMs可负载(7.13±0.39)mg P6蛋白;每毫升MCMs可负载(9.52±0.29)mg P6蛋白。粒度仪测得P6-CMs和P6-MCMs的平均粒径大小分别为(463.7±15.1)nm和(590.4±16.2)nm。扫描电镜下观察微球疫苗呈规则的球形,且分散性良好。体外测定微球疫苗的P6蛋白释放率,可明显观察到微球疫苗的缓释作用,且P6-MCMs释放率大于P6-CMs。将BALB/c小鼠随机分为5组:PBS组、MCMs组、P6组、P6-CMs组、P6-MCMs组,进行滴鼻免疫实验,以评价微球疫苗的黏膜免疫效果。间接ELISA检测小鼠血清中IgG抗体以及小鼠鼻腔和肺脏灌洗液中IgA抗体,结果显示:微球疫苗经滴鼻免疫后有效的激发了全身体液和黏膜免疫,微球疫苗组IgA和IgG抗体水平都显著高于单纯P6组,且P6-MCMs疫苗组高于P6-CMs,差异具有显著性。细胞因子试剂盒检测脾淋巴细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-17a,结果显示:P6-MCMs组IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-17a水平均显著高于其他组,而P6-CMs组与对照组、P6组相比,仅IL-4和IL-17a水平明显增高,说明P6-MCMs可引起混合型Th1/Th2和Th17细胞免疫反应,而P6-CMs只可引起Th2和Th17细胞免疫反应。流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群CD3~+、CD4~+和CD8a~+显示:P6-MCMs组T细胞亚型CD3~+、CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+均显著高于单纯P6组,说明P6-MCMs除了参与MHC Ⅰ类抗原递呈还参与MHCⅡ类抗原提呈。用NTHi ATCC49247对免疫小鼠进行鼻攻毒实验,HE染色观察小鼠鼻黏膜和肺组织病理变化,经免疫的小鼠P6、P6-CMs和P6-MCMs组鼻黏膜和肺组织中炎症反应明显弱于PBS组和MCMs组,炎症细胞明显减少且病理组织纹路更加清晰。本研究成功制备了甘露糖修饰多糖微球载体流感嗜血杆菌P6疫苗,经鼻黏膜免疫可引起有效的系统体液免疫和黏膜免疫,诱导混合型Th1/Th2、Th17细胞免疫应答,可通过MHC Ⅰ/MHC Ⅱ两种提呈途径,激发CD4~+介导的Th细胞免疫应答和CD8~+介导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)杀伤免疫反应。P6-MCMs显著的免疫效果提示P6-MCMs在体内靶向了APC表面的甘露糖受体,从而提高APC抗原提呈能力。免疫保护性实验显示P6-MCMs对不可分型流感嗜血杆菌的感染有一定的预防作用。