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目的:探讨铜暴露与多囊卵巢综合征的关联性,并进一步研究铜暴露对人卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的影响及其机制。方法:1.收集2017年3月至2018年3月在我校附属省妇幼保健院辅助生殖技术研究室行卵胞浆内单精子显微注射技术的PCOS患者及对照组的临床基础数据和卵泡液。用ICP-MS检测卵泡液中22种元素的含量;主成分(PCA)和偏最小二乘判别(PLSDA)分析卵泡液的元素谱变化;Logistic回归分析卵泡液铜浓度与优质胚胎率的关系;线性回归分析卵泡液铜浓度与获卵数和AMH介导效应的关系;相关分析用于分析卵泡液铜浓度与年龄、AMH和卵泡液类固醇水平之间的相关性;ELISA法检测卵泡液睾酮与孕酮的水平。2.分离2018年4月至2019年1月在我校附属妇幼保健院辅助生殖技术研究室行卵胞浆内单精子显微注射技术非卵巢性不孕患者的卵巢颗粒细胞,用0、1、2、5、10、20和40μg/m L的铜染毒24h后,CCK8法检测细胞增殖活力;ELISA法检测培养液中孕酮、雌二醇和睾酮的水平;实时荧光定量PCR测定人卵巢颗粒细胞类固醇激素合成相关基因St AR、HSD3B1、CYP11A1、HSD17B1、CYP19A1、FSHR和SF-1的表达;Western-blot法及免疫荧光法检测FSHR和SF-1的表达水平。3.(1)将人卵巢颗粒细胞体外培养48h后分为六组:对照组、20μg/m L Cu组、FSH组(激动剂:50m IU/m L)、FSH+20μg/m L Cu组、BI-10组(抑制剂:30m M)、BI-10+20μg/m L Cu组,暴露24h后采用实时荧光定量PCR、western-blot法以及免疫荧光法检测FSHR的表达水平;实时荧光定量PCR检测CYP19A1表达;测定ELISA法检测细胞培养液中孕酮和雌二醇水平。(2)人卵巢颗粒细胞体外培养48h后,分别用0、2、20和40μg/m L的铜暴露24h后采用结合重亚硫酸盐测序法(BSP)检测SF-1基因启动子区的甲基化水平,进一步采用实时荧光定量PCR法检测甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表达水平。结果:1.(1)PCOS和输卵管阻塞及对照组患者在年龄、BMI、E2、FSH、PRL、子宫内膜厚度、受精率、卵裂率、卵泡液总量和优质胚胎率的差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,PCOS组的LH,T和AMH水平以及获卵数显著增加(P<0.05),而FSH却显著减少(P<0.05)。(2)PCA分析和PLS-DA分析显示PCOS组卵泡液元素谱与其它两组有较为明显的差异;经计算VIP值发现VIP大于1的有:铜、镁、钙、钛、砷、锶,其中铜的VIP值最高。(3)单因素方差分析显示PCOS组卵泡液中铜浓度(1064.53±243.75)μg/L显著高于其它两组(920.91±305.89,877.98±239.73)μg/L(P<0.05)(4)相关性分析显示,卵泡液铜浓度与获卵数呈正相关(Β=1.785,P=0.001);与优质胚胎率呈负相关(Β=-6.360,P=0.05);与年龄呈负相关(r=-0.168,P=0.002),与血清AMH水平(r=0.228,P<0.001),卵泡液T水平(r=0.250,P=0.022)和P4水平(r=0.275,P=0.010)呈正相关。2.(1)与对照组相比,40μg/m L浓度的铜会导致细胞增殖下降(P<0.05)。(2)与对照组相比,40μg/m L Cu组人卵巢颗粒细胞培养液中P4水平降低(P<0.05),1、2μg/m L Cu组人卵巢颗粒细胞培养液中E2水平均升高(P<0.05),而20、40μg/m L Cu组人卵巢颗粒细胞培养液中E2水平均降低(P<0.05),人卵巢颗粒细胞培养液中T的水平在1、2μg/m L Cu组中均降低(P<0.05)。(3)与对照组相比,在20、40μg/m L Cu组中St AR,CYP11A1,HSD3B1和CYP19A1的m RNA表达水平均下调(P<0.05);在1、2和5μg/m L Cu组中CYP19A1的m RNA表达水平均上调(P<0.05);HSD17B1的m RNA表达水平在2、5、10、20和40μg/m L Cu组中均上调(P<0.05)。(4)与对照组相比,2μg/m L Cu组中FSHR的m RNA和蛋白表达均上调(P<0.05),而20μg/m L和40μg/m L Cu组FSHR的表达均下调(P<0.05);免疫荧光法检测结果与PCR和Western blot结果一致。(5)与对照组相比,2μg/m L Cu组SF-1的表达上调(P<0.05),而20、40μg/m L Cu组SF-1的表达下调(P<0.05)。3.(1)与20μg/m L Cu组相比、加入抑制剂(BI-10)后,FSHR的表达进一步下调(P<0.05);而加入FSH后,FSHR表达有所上调(P<0.05)。(2)与20μg/m L Cu组相比、加入抑制剂(BI-10)后,CYP19A1的m RNA表达水平和E2水平进一步降低(P<0.05);而加入FSH后,CYP19A1的m RNA表达水平和E2水平有所上升(P<0.05)。(3)对照组、2、20和40μg/m L Cu组SF-1启动子区总甲基化率分别为27.14%、7.62%、17.62%和0.71%。与对照组相比,2、20和40μg/m L Cu组总甲基化率均降低(χ2=146.50,P<0.001)。(4)与对照组相比,在2、20和40μg/m L Cu组中DNMT1与DNMT3A的m RNA表达均下调(P<0.05),而DNMT3B的m RNA表达水平在各个剂量组之间差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:1.PCOS卵泡液元素谱发生明显改变,卵泡液铜浓度明显上升,并与卵泡发育障碍相关联。2.铜可通过影响类固醇激素合成相关基因的表达,进而影响人卵巢颗粒细胞类固醇激素的合成。3.FSHR是铜暴露致人卵巢颗粒细胞类固醇激素合成障碍的重要靶点;铜可导致人卵巢颗粒细胞SF-1启动子区甲基化模式发生改变,从而影响类固醇激素合成,这与铜改变甲基转移酶表达有关。