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目的:dynactin是突触-胞质逆行运输复合物成员之一,在突触到胞质的运输途径中起重要作用。正常人大脑中dynactin表达随年龄增加而增加,帕金森病患者大脑中dynactin表达却在随年龄增加而减少,提示dynactin的变化可能和帕金森病发生机制有关。为寻找帕金森病早期病变即多巴胺神经元退行性病变的原因,为帕金森病早期诊断提供依据。本实验围绕dynactin展开,研究其功能障碍是否会造成帕金森病样症状,是否会造成多巴胺神经元退行性病变,如果造成多巴胺神经元退行性病变,那么其机制有哪些,是否会造成synuclein等蛋白异常聚集及自噬体增加。如果造成,其机制是否与dynactin逆行性轴浆运输这一功能受影响有关。材料与方法:本实验研究方法分为体内与体外两部分。(1)体内实验,利用浓度梯度dynactin特异性抑制剂MB抑制Tg(Vmat2-GFP)斑马鱼dynactin表达构建斑马鱼模型,通过统计生存率;观察斑马鱼外形变化、行为学改变;使用运动速率实验、明暗室实验,并与MPTP帕金森病斑马鱼模型比较,系统评估与帕金森病样症状相识与不同。使用活细胞工作站,激光共聚焦等设备,实时观察间脑多巴胺神经元数量变化;通过整胚免疫荧光方法观察synuclein聚集情况。(2)体外实验,dynactin-siRNA敲降SH-SY5Y细胞系。荧光免疫观察细胞内synuclein表达,在SH-SY5Y细胞系中转染mTagRFP-mWasabi-LC3观察Wasabi与TagRFP表达及分布,使用WB测定LC3-II,P62表达水平判断自噬流途径。使用活细胞工作站、激光共聚焦等设备观察稳转synuclein-GFP质粒和mTagRFP-mWasabi-LC3质粒后细胞内轴突运输状态。免疫荧光双标dynactin和dynein确定逆行性轴浆运输受阻状况。结果:(1)抑制斑马鱼dynactin表达后,斑马鱼胚胎、幼鱼存活率及孵化效率下降,胚胎孵化延迟,尾部弯曲畸形,脊柱僵直,平衡失态,震颤,心包水肿。斑马鱼运动能力减弱,表现为自由运动速率和机械刺激后运动速率减慢。通过观察活体Tg(Vmat2-GFP)转基因斑马鱼间脑多巴胺神经元情况,发现降低dynactin的表达造成多巴胺神经元数量明显减少。(2)在SH-SY5Y细胞内降低dynactin表达,造成帕金森病相关基因表达变化,synuclein蛋白大量聚集且分布异常,主要在轴突和胞质近轴突端大量聚集。在dynactin-siRNA敲降组中,由LC3标记的自噬小泡在胞质近轴突端和膜周围大量聚集,这与典型的诱导自噬途径不同,自噬体并不以核周增多为主。结合WB结果证明自噬流诱导途径增加,dynactin的减少造成自噬体位置的改变,可能是造成synuclein最终聚集在上述位置的原因之一。(3)实时观察SH-SY5Y细胞,发现细胞内形成大量神经珠,且synuclein和LC3的轴浆逆行性运输发生障碍。逆行轴浆运输dynein-dynactin复合体形成减少,分布异常,由散在分布变为在胞质近轴突端和突触集中分布。dynactin减少造成逆行轴浆运输障碍,导致多巴胺神经元退行病变。结论:本实验确立mycalolide B(MB)浓度为33.4~50.3μg/L区间内建立的斑马鱼模型,在行为学与形态学上和传统MPTP建立的帕金森病动物模型相似,说明dynactin降低造成类帕金森病症状,主要表现为运动能力减弱,姿态异常等。特异敲降和抑制dynactin,斑马鱼多巴胺神经元减少,说明抑制dynactin造成多巴胺神经退行性病变。斑马鱼和SH-SY5Y细胞内synuclein大量聚集胞质近轴突端和突触与路易士小体形成部位一致,提示dynactin功能障碍产生帕金森病样病理变化。LC3近轴突端和膜周围大量聚集特点可能和synuclein在胞质近轴突端和突触聚集有关,而且与通过WB证实的自噬流诱导途径增加现象推测可能是逆行性轴浆运输障碍造成。活细胞观察细胞内物质运输,以及synuclein,LC3运输,dynein和dynactin分布异常都提示细胞内逆行性轴浆运输障碍。综上所述,dynactin减少导致逆行性轴浆运输受阻,进而造成synuclein蛋白在轴突和胞质近轴突端聚集,代谢受阻,自噬增加,最终导致多巴胺神经元退行病变。