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第一部分 USP15在非小细胞肺癌细胞系中的表达及其生物学行为目的检测泛素特异性蛋白酶15(USP15)在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株及肺正常上皮细胞株中的表达,同时探讨其在体外和体内对生物学行为的影响。方法体外培养人肺癌细胞系A549和H1299以及人肺上皮细胞系BEAS-2B;Westernblot检测并比较A549,H1299和BEAS-2B中USP15的表达情况:设计并合成靶向USP15的shRNA序列,构建载体后包装成慢病毒,采用慢病毒感染将USP15干扰序列转染到肺癌细胞中,构建干扰USP15的USP15KD A549和USP15KD H1299稳转细胞模型,Westernblot检测干扰USP15细胞模型USP15KD A549和USP15KD H1299中USP15蛋白表达,运用CCK8检测干扰USP15前后A549和H1299细胞增殖情况,运用Transwell实验观察干扰USP15前后A549和H1299细胞的侵袭性,应用 Westernblot 检测干扰 USP15 前后 A549 和 H1299 细胞中 MMP2,MMP3 和 MMP9蛋白表达变化;尾静脉注射H1299或USP15KD H1299细胞进行裸鼠成瘤实验,取新鲜肺组织观察肿瘤结节质量和个数,取肺组织行石蜡切片HE染色观察裸鼠成瘤情况。结果1.人肺癌细胞系A549和H1299中USP15蛋白表达量明显高于人肺上皮细胞BEAS-2B中USP15的蛋白表达量(P<0.05);2.成功建立干扰USP15蛋白表达的人肺癌细胞模型 USP15KD A549 和 USP15KD H1299,USP15KD A549 中 USP15蛋白表达量较A549中USP15的蛋白表达量明显下降(P<0.05),USP15KD H1299中USP15蛋白表达量亦较H1299中USP15的蛋白表达量明显下降(P<0.05);3.CCK8结果显示培养细胞3 d,4 d和5 d时USP15KD A549细胞增殖能力明显低于A549细胞(P<0.05);培养细胞3 d,4d和5d时USP15KD H1299细胞增殖能力亦明显低于H1299细胞(P<0.05);4.Transwell侵袭实验结果显示USP15KDA549细胞侵袭能力明显低于A549细胞(P<0.05);USP15KD H1299细胞侵袭能力明显低于H1299细胞(P<0.05);5.Westernblot结果显示USP15KD A549细胞中金属蛋白酶MMP3和MMP9相对表达量明显低于A549中MMP3和MMP9的表达量(P<0.01);USP15KD H1299细胞中金属蛋白酶MMP2、MMP3和MMP9相对表达量明显低于H1299中MMP2、MMP3和MMP9的表达量(P<0.01);6.体内实验结果显示USP15干扰抑制肺癌细胞H1299的肿瘤形成,USP15KD H1299组裸鼠肺结节个数明显少于H1299组,USP15KDH1299组裸鼠肺肿瘤总重量亦低于H1299组(P<0.05)。结论USP15在NSCLC中呈高表达,USP15基因的敲减能够抑制NSCLC的增殖能力及侵袭能力,且能够抑制体内移植瘤的生长;提示USP15也许可作为一个新的分子靶点用于NSCLC的靶向治疗。第二部分 USP15在人非小细胞肺癌患者组织中的表达及其临床意义目的检测USP15在人NSCLC患者癌组织及癌旁组织中的表达。方法选取盐城市第三人民医院心胸外科30例NSCLC手术患者,取原发病灶新鲜肿瘤组织和癌旁组织,经固定、石蜡包埋、切片后行免疫荧光检测观察癌组织和癌旁组织中USP15表达情况;同时取上述患者部分癌组织和癌旁组织,运用定量PCR及westernblot检测USP15在两组间的基因及蛋白差异表达。结果1.免疫荧光结果显示USP15在NSCLC患者癌组织中表达明显高于癌旁组织;鳞癌组织、腺癌组织和腺鳞癌组织中USP15阳性细胞单个细胞平均荧光强度均明显高于相应癌旁组织中USP15阳性细胞单个细胞平均荧光强度,差别有统计学意义(P<0.05);同时鳞癌组织,腺癌组织和腺鳞癌组织中40倍视野下平均USP15阳性细胞数均明显高于癌旁组织中40倍视野下平均USP15阳性细胞数(P<0.05);2.NSCLC患者癌组织中USP15基因表达水平明显高于癌旁组织中表达水平(P<0.05);3.NSCLC患者癌组织中USP15蛋白相对表达量明显高于癌旁组织中USP15蛋白表达量(P<0.05)。结论NSCLC患者癌组织中的USP15的基因和蛋白水平均呈高表达,提示USP15可能与人NSCLC的发生发展有关。第三部分 USP15在人非小细胞肺癌患者血清中的表达及其临床意义目的检测USP15在人NSCLC患者血清中的表达,分析其与临床病理特征的关系,同时探讨USP15作为标志物单独检测或与其他参数联合检测用于诊断NSCLC的临床价值。方法选取NSCLC患者73例、肺部良性疾病(BLD)患者60例、健康体检者(HC)51例,采用酶联免疫法(ELISA)检测血清USP15水平,电化学发光法检测血清癌胚抗原(CEA),细胞角蛋白片段19(CYFRA21-1),神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平,运用二元Logistic回归分析USP15及相关参数水平与NSCLC发生的风险关系,通过绘制受试者特征工作曲线(ROC曲线)评价USP15及相关参数单独或联合检测对NSCLC的诊断价值,根据曲线下面积(AUC)评价各参数的诊断效能,计算约登指数,根据约登指数的最大值确定最佳诊断临界值,以及敏感度和特异度。结果NSCLC患者血清USP15水平显著高于BLD患者及HC,差异均有统计学意义(P<0.01),且BLD患者高于HC者(P<0.01)。NSCLC患者中,血清USP15水平在TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的患者显著高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.01);而在不同年龄、性别、病理类型、分化程度及是否有淋巴结转移患者的比较中无统计学差异(P>0.05)。Logistic回归分析表明,USP15与NSCLC发生风险关系呈显著正相关(OR:1.004,95%CI:1.002-1.005,P<0.01);USP15 诊断 NSCLC 的曲线下面积(AUC)为 0.796,95%CI为0.730～0.863,当USP15取约登指数的最大值0.52时,此时最佳Cut-off值为1.24 ng/mL,其对应的敏感度为74%,特异度为78%;USP15与CYFRA21-1组合对NSCLC诊断的AUC为0.865,95%CI为0.810～0.921,此时取约登指数的最大值0.66时,敏感度和特异度分别为86%及79%;USP15与CEA组合对NSCLC诊断的AUC为0.830,95%CI为0.770～0.890,此时取约登指数的最大值0.56时,敏感度和特异度分别为80%及77%;USP15与CYFRA21-1及CEA共同组合对NSCLC诊断的AUC为0.878,95%CI为0.826～0.930,此时取约登指数的最大值0.66时,敏感度和特异度分别为87%及75%。结论NSCLC患者血清USP15水平呈高表达,是NSCLC的风险因素,其表达与NSCLC分期及分化程度密切相关;血清USP15与CYFRA21-1联合检测可提高对NSCLC诊断的敏感性及特异性,其有望作为一个新的血清标志物用于肺癌的诊断。