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番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的代表种,其基因组包括三条单链RNA(L、M和S):RNA L(约8.9kb)为负义RNA,其互补链编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),RNA M和RNA S均为双义RNA,其中M编码非结构蛋白NSm以及糖蛋白Gn-Gc,S编码非结构蛋白NSs以及核衣壳蛋白N。由RNA M和S编码的4个蛋白(NSm、Gn-Gc、NSs和N)分别从4个亚基因组上表达,但关于其精确的3’末端定位未见报道。本文首先通过RT-PCR克隆得到来自中国云南省不同发病寄主(烟草,辣椒,甜椒)上的TSWV全基因组序列。通过对Genbank数据库中所有的29个L,62个M和66个S基因组序列统计发现:1.M和S基因组的长度变化较L更为明显;2.有蛋白编码区的长度几乎没有变化;3.M和S基因组的长度变化与各自的基因组间隔区(IGR)的长度变化密切相关。然后,通过DNAMAN软件分析5个中国分离物间的核苷酸和氨基酸的分子变异,同时利用MEGA 5.0软件对世界范围内的TSWV分离物进行系统进化树分析,结果显示:1.本文克隆的三个TSWV中国分离物与TSWV中国番茄分离物的亲缘关系较近;而与TSWV中国莴苣分离物的遗传距离很远;2.TSWV的不同分离物间存在明显的RNA重排现象。利用RDP4软件对世界范围内的TSWV分离物的重组分析发现了高频率的重组事件,而发生在负链RNA病毒间的RNA重组之前只有少数报道,且均为低频率重组;并且在TSWV中发生的重组存在明显的区域选择性;重组大多发生在RNA的5’部分,其中在RNA M和S中尤为显著。为精细研究TSWV亚基因组的翻译调控,通过3’-RACE对TSWV中国烟草分离物RNA M(KM657118)和RNA S(KM657115)产生的亚基因组(sgRNA)进行3’末端定位,测序结果亚基因组sgRNA-NSm的3’末端对应于RNA M的A1080,长度为1080nt;亚基因组sgRNA-(Gn-Gc)的3’末端互补于RNA M的U1200,长度为3573nt;亚基因组sgRNA-NSs的3’末端对应于RNA S的C1702,长度为1702 nt;亚基因组sgRNA-N的3’末端互补于RNA S的A1865,长度为1106nt。利用DNAMAN的序列比对发现,虽然不同TSWV的RNA M和S的IGR区的长度与核苷酸序列存在较大差异,但亚基因组的3’末端碱基及其邻近序列则非常保守。所有来自RNA M和S的亚基因组的3’UTR只包括各自IGR的一部分,并且利用Mfold的RNA二级结构预测表明,亚基因组的3’末端碱基均位于基因间隔区(IGR)的茎环结构的茎部,且与其亚基因组编码蛋白同侧。利用萤火虫荧光素酶(Fluc)的报告基因载体研究TSWV RNAS的亚基因组翻译调控,将相应亚基因组的5’UTR和3’UTR分别插入到Fluc的上下游,根据研究结果进行后续的突变分析。主要结果如下:1.亚基因组(sgRNA-NSs、sgRNA-N)5’UTR对于Fluc翻译有正调控作用;在5’UTR存在的前提下,亚基因组3’UTR则会进一步增强翻译,即亚基因组5’UTR和3’UTR协同调控翻译;2.缺失突变分析发现,5’UTR的1-15nt核苷酸对增强翻译至关重要;并且反式竞争实验表明,亚基因组5’UTR对翻译的增强作用可能通过结合核糖体或翻译起始因子而实现;3.缺失突变分析表明,亚基因组3’UTR的A-rich区对于3’UTR协同调控翻译很重要,此A-rich区可能与poly(A)的作用机制类似。