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一.研究背景和目的结直肠癌(colorectal cancer)是世界第二大恶性肿瘤,占世界死亡率的9.2%。早期诊断和息肉切除可以预防癌症,降低死亡率,因此,结直肠癌的筛查手段对于早期诊断结直肠癌具有重要意义。近年来,随着表观遗传学研究的进展,DNA甲基化成为了目前研究最多,最清楚的表观修饰方式。在肿瘤的发生发展中,DNA甲基化异常是其重要的诱因,其在肿瘤发生的早期阶段即可发生兼其具有组织特异性,提示甲基化可作为新的肿瘤分子标志物具有独特的优势。目前的结直肠癌的筛查方式中非入侵性检测方法对早期结直肠癌的检测敏感性有限,而侵入性检查给患者带来不适且费用昂贵。因此,准确的生物标志物和非侵入性方法检测早期结直肠癌成为临床迫切需要。本课题组在前期研究中发现了一组辨别结直肠癌的相关基因位点,我们接下来的工作是在组织样本中验证这组甲基化基因的辨别结直肠癌的能力,建立预测早期结直肠癌的数学模型,为结直肠癌的无创性早诊早筛,预后分期提供参考数据。二.研究方法1.先后入组南方医科大学结直肠癌患者石蜡组织样本:非癌组织和结直肠癌组织共计95例,并进行不同组织亚型分组;收集临床资料。2.采用二甲苯脱蜡,使用Qiagen公司的ALLPrep DNA/RNA FFPE Kit进行提取石蜡切片组织基因组DNA(gDNA)和RNA;质检后-20℃保存基因组DNA。3.Methlight检测组织DNA甲基化:将提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化,转化具体操作按照Zymo DNAMethylation-Direct MagPrep试剂盒的操作步骤进行;亚硫酸盐转化的产物全部用于进行多重甲基化扩增;对多重甲基化扩增产物进行特定甲基化探针的荧光测定,并计算荧光测定结果。4.数据统计采用R软件分析,组间比较采用T-test检验,比较各组间差异,p值<0.05为差异有统计学意义。早期预测模型的建立使用R软件,建立ROC曲线使用pROC包,绘制boxplot图用ggplot2包。三.结果1.在这一组基因中,SFMBT2,ITGA4,THBD,ZNF304,KCNJ12,VAV3-AS1,EVC,TWIST1这8个基因可以显著区分癌组织与非癌组织(T-test检验)。2.在结直肠癌组织中,KCNJ12_VAV3-AS 1_EVC三个甲基化标志物的组合可以显著区分早期结直肠癌变(stage0-stagel)和中晚期结直肠癌(stageⅡ-stageⅣ)3.我们挑选最优基因组合SFMBT2,ITGA4,THBD,ZNF304,建立logistic回归数学模型,并绘制ROC曲线检测其预测结果,训练集的平均AUC值为0.97,测试集的平均AUC值为0.96。四.结论在我们这组研究的这组基因中,8个甲基化标志物都可以显著辨别结直肠癌,两组用于CRC的早期检测、CRC分期的预测的甲基化标志物在组织水平上进行了验证,其分类模型在入组队列中显示出良好的临床表现,有望成为结直肠癌早筛的潜在的生物标志物。