缺血性心脏病是导致人类死亡的重要原因,探索对抗缺血受损心肌的保护方法及其机制是心血管领域的一个研究重点与热点,具有十分重要的理论与应用价值。缺血性心脏病及其术后并发症(如再灌注损伤)存在不同程度的心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)的主要病理机制之一,它与心肌IRI的发生与发展密切相关。心肌细胞凋亡的数量决定心肌损伤的程度,严重时可引起心功能障碍,甚至心功能衰竭。在缺血再灌注时,通过抑制心肌细胞凋亡可以显著缩小心肌梗死面积和有效减少心功能紊乱的发生。研究表明,成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors,FGFs)能促进细胞的增殖、迁移,促进血管新生,改善心肌血供,对抗心肌坏死和凋亡,对缺血心肌具有较好的保护作用,可为对抗缺血引起的心肌损伤提供新思路。FGFs是具有22个成员的肝素生长因子家族,其中成纤维细胞生长因子-2(Fibroblast growth factor-2,FGF-2,又称碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast growth factor,b FGF))的作用倍受关注。FGF-2是多功能生长因子,能促进细胞增殖、分化和迁移,具有强大的促血管新生作用。研究表明,FGF-2是一种重要的内源性细胞保护物质,具有明显的心肌保护作用。本课题组和其他研究者的实验表明,FGF-2对缺血心肌的保护作用与其结合FGF受体1(FGFR1),激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)等细胞内信号通路相关。但PKC和MAPKs种类的多样性及其亚类功能的不一致性使得这两类蛋白激酶在介导FGF-2引起的心肌保护作用中情况变的复杂,而且FGF-2的心肌保护效应也难以完全用PKC、MAPKs的激活来解释。因此,寻找FGF-2心肌保护作用的其它机制显得十分必要和重要。糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)是一种在体内广泛表达的多功能丝/苏氨酸蛋白激酶。GSK-3可分布在细胞质基质、线粒体和细胞核,而线粒体和细胞核中GSK-3活性要比细胞胞浆中的更高。人的GSK-3具有GSK-3α和GSK-3β2个亚型。GSK-3α/β分别存在与其功能密切相关的2个非常重要的磷酸化位点——Tyr279/Tyr 216和Ser21/Ser9。在细胞静息状态时,以Tyr279/Tyr216磷酸化为主,使GSK-3α/β保持激活状态,如Ser21/Ser9发生磷酸化,则抑制GSK-3α/β活性。大量的研究显示,GSK-3β在心肌保护中具有非常重要的意义。各类具有心肌保护作用的信号通路汇聚于GSK-3β,使GSK-3βSer9磷酸化,抑制GSK-3β活性,从而缩小心肌梗死面积,拮抗心肌细胞凋亡,改善心功能,对抗心率失常,发挥心肌保护作用。酪氨酸激酶受体FGFR1激活后,通常会激活PLC-PKC,Ras-MAPKs和PI3K-PKB/Akt信号通路。研究表明,PI3K-Akt/PKB-GSK-3β信号通路在心肌保护中扮演重要角色。心肌缺血预处理(Ischemic preconditioning,IPC)、心肌缺血后处理(Ischemic postconditioning,IPost C)、硫化氢及一些药物的抗心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)作用都与激活PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路有关。文献表明:FGF-2可以通过激活PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路,拮抗慢性内质网应激所诱导的神经细胞凋亡;促进人胚神经干细胞向运动神经元细胞分化;使前列腺癌细胞发生上皮细胞间质转型(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)。PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路能否介导FGF-2的心肌保护作用?目前不清楚。因此,本研究提出“FGF-2可能通过激活PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路发挥心肌保护作用”的科学假设。为验证这一假设,首先采用大鼠离体心脏缺血/再灌损伤模型和心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,观察FGF-2对心肌梗死面积、心功能和心肌细胞凋亡的影响及PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路的变化;然后采用心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,探索GSK-3β如何介导FGF-2抗心肌细胞凋亡的作用。通过这些研究,旨在揭示FGF-2心肌保护作用的新机制和新途径,进一步阐明这一重要的内源性细胞保护物质的生理与病理意义,为缺血性心脏病的治疗提供新思路和新的干预环节。第一部分FGF-2心肌保护作用的新机制探索:PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路的作用目的:探索PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路在FGF-2心肌保护中的作用方法:1.观察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路在FGF-2对抗大鼠离体心脏IRI的作用。利用Langendorff心脏灌流系统建立大鼠离体心脏缺血再灌注损伤(IRI)模型,47只SD大鼠随机分为7组,每组6~7只:(1)缺血再灌注组(I/R):K-H液灌流平衡30min,接着K-H液再灌流5分钟,停灌30分钟,复灌60分钟;(2)I/R+LY294002组(LY294002):在I/R的基础上,在停灌前5分钟和复灌的全程使用含有15μM的PI3K特异性抑制剂LY294002 K-H液灌流;(3)I/R+SH-5组(SH-5):在I/R的基础上,给予含有10μM PKB/Akt抑制剂SH-5的K-H液灌流,SH-5的使用方式与LY294002相同;(4)I/R+SB216763组(SB216763):在I/R的基础上,在再灌注前5分钟和整个再灌注内给予含有3μM GSK-3β抑制剂SB216763的K-H液灌流;(5)I/R+FGF-2组(FGF-2):在I/R的基础上,在复灌最初10分钟给予含有FGF-2(10μg/heart)K-H液灌流;(6)I/R+FGF-2+LY294002组(FGF-2+LY294002):FGF-2与LY294002分别按FGF-2组和LY294002组的方式与剂量给与;(7)I/R+FGF-2+SH-5组(FGF-2+SH-5):FGF-2与SH-5分别按FGF-2组和SH-5组的方式与剂量给与。采用1%氯化三苯基四氯唑(TTC)染色检测心肌梗死面积;全自动生化分析仪测定冠脉流出液LDH活性;生物信息采集系统记录左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张压(LVDP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax);TUNEL结合DAPI染色检测心肌组织细胞凋亡情况;Western blot检测各组Akt、p-Akt(Ser 473)、GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平。2.观察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路在FGF-2对抗心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的作用。(1)观察FGF-2对正常心肌细胞Akt和GSK-3β活性的影响。用10 ng/ml FGF-2分别处理H9c2心肌细胞0、5、10、20、30、60分钟,采用Western blot检测Akt、p-Akt(Ser 473)、GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达。(2)观察H/R对心肌细胞损伤及Akt与GSK-3β活性的影响。首先将体外培养的H9c2心肌细胞随机分为:(1)正常组;(2)缺氧90分钟组;(3)缺氧90分钟,复氧120分钟组。采用CCK-8比色法检测心肌细胞存活率。然后将H9c2心肌细胞依次缺氧0、0.5、1、2小时,在缺氧2小时的基础上,再依次复氧0.5、1、2、12和24小时,Western blot分别检测Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β的表达水平。(3)观察FGF-2对H/R心肌细胞损伤及Akt与GSK-3β活性的影响。H9c2心肌细胞随机分为:(1)正常组;(2)H/R组;(3)H/R+FGF-2组。采用CCK-8比色法检测心肌细胞存活率;流式细胞术和TUNEL检测心肌细胞凋亡率;Western blot分别检测Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β的表达水平。(4)观察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路在FGF-2对抗H/R所诱导心肌细胞损伤的作用。首先,将体外培养的H9c2心肌细胞随机分为:(1)正常组(Control);(2)H/R组;(3)H/R+FGF-2组(FGF-2);(4)H/R+FGF-2+LY294002组(FGF-2+LY294002);(5)H/R+FGF-2+SH-5组(FGF-2+SH-5)。以含10ng/ml FGF-2的DMEM培养液培养心肌细胞30分钟后,缺氧90分钟,复氧120分钟,其中10μmol/L LY294002或5μmol/L SH-5在缺氧前1小时加入。复氧结束后,采用CCK-8比色法检测心肌细胞存活率;TUNEL和流式细胞术检测心肌细胞凋亡;采用Western blot检测Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表达。然后,观察GSK-3β-WT、具有较高激酶活性的GSK-3β-S9A突变体和激酶活性丧失的GSK-3β-K85R突变体对心肌细胞GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表达的影响。将V5Tag标记的pc DNA3/GSK-3β-WT、pc DNA3/GSK-3β-S9A、pc DNA3/GSK-3β-K85R质粒扩增,抽提和测序。接着将pc DNA3/GSK-3β-WT、pc DNA3/GSK-3β-S9A和pc DNA3/GSK-3β-K85R分别转染心肌细胞。质粒成功转染48小时后,采用Western blot检测各组细胞V5Tag的表达水平。随后实验分组:(1)空白对照组(Con);(2)空载体组(Vec);(3)GSK-3β-WT组(WT);(4)GSK-3β-S9A组(S9A);(5)GSK-3β-K85R组(K85R)。采用Western blot方法检测GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达。最后,观察FGF-2对H/R心肌细胞中凋亡相关蛋白的影响。将GSK-3β-WT、GSK-3β-S9A突变体和GSK-3β-K85R突变体成功转染心肌细胞,实验分组:(1)正常组(Control);(2)H/R组;(3)H/R+GSK-3β-K85R组(H/R+K85R);(4)H/R+GSK-3β-S9A组(H/R+S9A);(5)H/R+FGF-2组;(6)H/R+GSK-3β-S9A+FGF-2组(H/R+S9A+FGF-2)。采用Western blot检测细胞胞浆和线粒体中Bax蛋白表达,Bcl-2、32KD Caspase-3和17KD Caspase-3蛋白表达。结果:1.离体心脏灌流研究发现,在复灌时给予FGF-2,心肌梗死面积较缺血再灌注组减少42.3%(P<0.01),冠脉流出液中LDH活性降低32.8%(P<0.01),LVSP增加25.8%,LVDP增加38.5%,±dp/dtmax绝对值分别增加35.9%和52.0%(均P<0.01),心肌细胞AI(apoptosis index)降低52.3%(P<0.01),p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值分别增加112.5%和112.1%(均P<0.01)。PI3K特异性抑制剂LY294002和PKB/Akt抑制剂SH-5可以对抗FGF-2的心肌保护作用,FGF-2+LY294002组心肌梗死面积较FGF-2组增加40.2%(P<0.05),冠脉流出液中LDH活性增加25.6%(P<0.05),LVSP降低12.6%,LVDP降低17.2%,±dp/dtmax绝对值分别降低13.9%和22.4%(均P<0.05),p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值分别下降27.7%和27%(均P<0.05);FGF-2+SH-5组心肌梗死面积较FGF-2组增加29.5%(P<0.05),冠脉流出液中LDH活性升高20.0%(P<0.05),LVSP降低10.1%,LVDP降低13.4%,±dp/dtmax绝对值分别下降9.9%和17.5%(均P<0.05),p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值分别降低19.2%和20.3%(均P<0.05)。在复灌时给予GSK3β抑制剂SB216763,心肌梗死面积较缺血再灌注组减少43.6%(P<0.01),冠脉流出液中LDH活性降低41.1%(P<0.01),LVSP增加29.9%,LVDP增加46.6%,±dp/dtmax绝对值分别增加40.7%和58.7%(均P<0.01),p-GSK-3β/GSK-3β比值增加129.2%(P<0.01)。与缺血再灌注组相比,LY294002组和SH-5组心功能、心肌梗死面积、冠脉流出液中LDH活性、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值变化无显著差异(均P>0.05)。2.缺氧和H/R可以抑制心肌细胞活力(与正常组相比,P<0.01)。FGF-2可以明显提高H/R心肌细胞存活率,拮抗H/R所诱导心肌细胞凋亡(与H/R组相比,所有P<0.05);LY294002和SH-5可以对抗FGF-2的以上作用(与FGF-2组相比,所有P<0.05)。3.在正常心肌细胞研究发现,FGF-2可以动态调节心肌细胞Akt和GSK-3β的活性;缺氧可以短暂性激活Akt,H/R先激活后抑制Akt的活性;缺氧可以短暂性抑制GSK-3β的活性,H/R先抑制后激活GSK-3β;FGF-2显著促进H/R心肌细胞p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达(与H/R组相比,所有P<0.01),其作用能被LY294002或SH-5拮抗(与FGF-2组相比,所有P<0.05)。4.测序结果显示,GSK-3β-WT基因序列是正确的,GSK-3β-S9A突变体的9位丝氨酸确实被丙氨酸取代,GSK-3β-K85R突变体的85位赖氨酸确实被精氨酸取代;本实验所采用的方法可以将GSK-3β-WT、GSK-3β-S9A和GSK-3β-K85R有效转染心肌细胞;GSK-3β-WT组、GSK-3β-S9A组和GSK-3β-K85R组p-GSK-3β/GSK-3β比值明显降低,以GSK-3β-S9A组最低(与空白对照组相比,P<0.05)。5.H/R促进Bax由细胞胞浆转入线粒体,激活Caspase-3及抑制Bcl-2蛋白的表达(与正常组相比,P<0.05);FGF-2和GSK-3β-K85R突变体可以抑制H/R的以上作用(与H/R组相比,P<0.05);GSK-3β-S9A突变体可以逆转FGF-2对H/R的抑制作用(与H/R+FGF-2组相比,P<0.05)。结论:1.FGF-2能拮抗大鼠心肌I/R损伤和心肌细胞H/R损伤,具有良好的心肌保护作用;2.PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信号通路的激活介导FGF-2拮抗的大鼠心肌I/R损伤和心肌细胞H/R损伤,是FGF-2心肌保护作用新的分子机制。第二部分线粒体GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2抗心肌细胞凋亡中的作用目的:探索GSK-3β介导FGF-2抗心肌细胞凋亡的机制。方法:1.观察GSK-3β在H/R心肌细胞凋亡中的作用。H9c2心肌细胞随机分为:(1)正常组(Normal);(2)H/R组;(3)H/R+Control si RNA组(Control si RNA);(4)H/R+GSK-3βsi RNA组(GSK-3βsi RNA);(5)H/R+SB216763组(SB216763)。心肌细胞成功转染GSK-3βsi RNA 48小时后或预孵育3μM GSK3β选择性抑制剂SB216763 30分钟后,接着缺氧90分钟,复氧120分钟。复氧结束后,采用TUNEL结合DAPI染色检测各组心肌细胞凋亡情况。2.观察GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2对抗H/R心肌细胞凋亡中的作用。将GSK-3β-S9A和GSK-3β-K85R质粒成功转染心肌细胞,实验分组:(1)正常组(Normal);(2)H/R组;(3)H/R+GSK-3β-K85R组(GSK-3β-K85R);(4)H/R+GSK-3β-S9A组(GSK-3β-S9A);(5)H/R+FGF-2组(FGF-2);(6)H/R+GSK-3β-S9A+FGF-2组(GSK-3β-S9A+FGF-2)。采用TUNEL结合DAPI染色检测各组心肌细胞凋亡情况。3.观察FGF-2对线粒体p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达的影响。首先,观察FGF-2对细胞GSK-3β蛋白表达的影响。心肌细胞随机分为:(1)正常组(Vehicle);(2)FGF-2组。采用免疫荧光检测GSK-3β蛋白表达。接着,观察FGF-2对细胞p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达的影响。心肌细胞随机分为:(1)正常组(Vehicle);(2)LY294002组;(3)FGF-2组;(4)FGF-2+LY294002组。采用免疫荧光检测p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达。最后,观察FGF-2对线粒体和细胞胞浆GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达的影响。心肌细胞随机分为:(1)正常组(Vehicle);(2)FGF-2组。采用Western blot检测线粒体和细胞胞浆中GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达。4.观察GSK-3βsi RNA对H/R心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响。H9c2心肌细胞随机分为:(1)正常组;(2)H/R组;(3)H/R+GSK-3βsi RNA组。采用Western blot检测Bcl-2、细胞胞浆和线粒体Bax蛋白表达。结果:1.GSK-3βsi RNA和SB216763可以拮抗H/R心肌细胞凋亡(与H/R组相比,P<0.05)。2.FGF-2和GSK-3β-K85R突变体抑制心肌细胞凋亡(与H/R组相比,P<0.05),GSK-3β-S9A突变体逆转FGF-2对H/R心肌细胞凋亡的抑制作用(与H/R+FGF-2组相比,P<0.05)。3.FGF-2对心肌细胞GSK-3β蛋白表达无影响,FGF-2促进心肌细胞p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达,而且主要以线粒体p-GSK-3β(Ser9)表达为主。4.GSK-3βsi RNA可以减轻H/R对Bcl-2蛋白表达的抑制作用,阻止Bax由细胞胞浆转入线粒体(与H/R组相比,P<0.05)。结论:1.线粒体GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2抗心肌细胞凋亡中起重要作用。