研究背景趋化因子是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子,分子量多在8-14kDa之间。趋化因子与趋化因子受体结合后传递多种细胞信息。趋化因子受体是7次跨膜G蛋白偶联受体中的一个家族。根据他们的两个保守的N-末端半胱氨酸残基,趋化因子及其受体分为CXC,CC,C,and CX3C家族。趋化因子基因分布在4q12-q13染色体（CXC主要趋化中性粒细胞）,4q21,和17q11.2（CC主要趋化单核细胞）。趋化因子受体的基因组存在于2和3染色体。许多趋化因子有着共同的受体和并能与多种受体结合。人们对趋化因子的最初认识是其能够趋化白细胞,现已被证明他们对多类型的细胞,包括T淋巴细胞均有趋化作用。趋化因子能诱导白细胞特别是T淋巴细胞,向炎症反应和肿瘤浸润局部移动。第一章致癌信号通路促进肿瘤的生长和入侵,也影响抗肿瘤免疫反应,包括免疫细胞动员（1-4）。Notch信号传递途径的自然活化见报于白血病,乳腺癌,肺癌,粘液瘤,卡波西氏肉瘤,神经母细胞瘤,胰腺癌,宫颈癌,以及黑色素瘤,此为探讨Notch信号传递途径作为一种治疗肿瘤的目标提供科学基础。然而,Notch信号传递途径的活化对趋化因子表达的影响尚未经研究调查。Notch信号途径传递从细胞表面的配体结合信号到细胞核转录系统。因此,人们试图用药物抑制gamma-secretase的活性以阻断Notch蛋白裂解,或siMAML1转染以阻断Notch信号转录活动。我们调查了人黑色素瘤细胞系M624经小siMAML1转染后多种基因的表达,发现Tweak受体（TweakR,Fn14）和几个趋化因子包括CCL2的表达显著上调。第二章CXCL16是一种跨膜趋化因子,在生理或病理状态的多种组织器官中都能检测到。在炎症和免疫反应中,CXCL16在巨噬细胞/树突状细胞（Dendriticcells,DC）与T细胞的反应和移动过程中起重要作用。细胞膜表面的CXCL16与T细胞表面的CXCR6结合还介导对T细胞的强力粘附作用。CXCL16不仅分布在细胞表面,这种跨膜受体蛋白经蛋白酶自然切割后也以可溶性蛋白小分子形式分泌,这个过程被称为脱落。LPA（Lysophosphatidic acid,LysoPtdOH）作为具有生物活性的磷脂酸,在创伤愈合及炎症反应中对DC细胞和上皮细胞功能有着重要影响。然而,CXCL16的表达与LPA的直接关系尚不清楚。用单核细胞来源的巨噬细胞/DC,我们研究了LPA刺激后CXCL16的基因和蛋白表达水平及其在细胞表面的分布变化。第三章树突状细胞（DC）分泌的趋化因子可调节DC自身的运动功能,也可以动员肿瘤免疫反应性T淋巴细胞。DC制造许多趋化因子,包括CCL2,CCL3,CCL4,CCL22。肿瘤细胞分泌的CCL2可能首先吸引肿瘤相关的单核细胞来源的DC（MoDC）/巨噬细胞到肿瘤微环境中,之后MoDC/巨噬细胞分泌的趋化因子又可以影响MoDC/巨噬细胞的进一步聚集和T淋巴细胞的浸润,从而调控肿瘤的生长行为。但是,最近在老鼠的实验中发现:未成熟的DC低表达MHC-II和不表达活化共刺激分子CD80/CD86等,他们被动员到肿瘤后,不能激活免疫反应,反而吸引更多的调节性T细胞（Treg）到肿瘤部位,结果导致免疫耐受。因此,在DC成熟过程中全面系统地监测DC的趋化因子的变化,将为发展用于肿瘤治疗的DC疫苗提供免疫学理论基础。血中单核细胞不断地产生巨噬细胞或者DC以维持体内环境稳定。利用纯化的单核细胞,我们在体外制备了MoDC,并研究它们在分化过程中趋化因子的表达特性,总体上,巨噬细胞和MoDC都继承了单核细胞的一系列趋化因子（CCL27,CXCL16,CXCL5,CCL24,CXCL3,CXCL8,CCL2,CCL4,CXCL7和CCL18）,MoDC显著上调CCL17,CCL22,CCL23的表达。研究目的调节肿瘤微环境中多种细胞来源的多种趋化因子的表达和功能。第一章研究用siMAML1阻断黑色素瘤细胞中Notch信号传递途径,诱导依赖于TweakR上调的CCL2的表达,引导更多免疫细胞动员入侵肿瘤微环境。第二章探索血清溶血磷脂酸（LPA）调节巨噬细胞/MoDC中CXCL16的生产和脱落的机理,了解LPA调节巨噬细胞对效应T细胞的趋化活性及其与G_i/o,Rho和NFκB通路的关系,探讨通过调节CXCL16以增加肿瘤局部免疫效应细胞的可行性。第三章观察来自单核细胞的不同分化阶段的MoDC产生的趋化因子表达水平,探讨调节CCL22和CCL17在细胞中转录表达的机制与信号传递途径,探索应用DC肿瘤疫苗治疗肿瘤时,特异性阻断CCL22和CCL17的表达与功能,减少Treg的趋化移动频率,同时吸引更多的T效应细胞到肿瘤部位去杀伤肿瘤细胞。研究方法第一章SiMAML1通过上调黑色素瘤细胞TweakR的表达诱导CCL2的产生1.用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测siMAML1,siHey1转染对靶基因（MAML1,Hey1）的抑制效果,及Tweak,TreakR和多种其他趋化因子基因的表达。2.用Western-blot检测以上分子相关蛋白的表达水平。3.用流式细胞术（FACS）分析TweakR在细胞表面的表达。4.用酶联免疫吸附试验（ELISA）测量CCL2在细胞培养上清中的表达水平。5.用单核细胞趋化实验检测黑色素瘤细胞分泌趋化因子（CCL2）对单核细胞的趋化功能。第二章LPA提高LPS刺激巨噬细胞产生CXCL16及调节细胞移动功能的研究1.用流式细胞术（FACS）分析LPA受体（LPA1,LPA2,LPA3）及趋化因子CXCL16在巨噬细胞,MoDC和单核细胞表面的表达。2.定性RT-PCR检测LPA受体（LPA1,LPA2,LPA3）基因在巨噬细胞,MoDC和单核细胞中的表达。3.用酶联免疫吸附试验（ELISA）测量CXCL16在细胞培养上清中的表达水平。4.用实时定量聚合酶链反应检测LPA/LPS对CXCL16基因表达的调节作用。5.用趋化实验检测巨噬细胞,MoDC和单核细胞分泌趋化因子（CXCL16）对T细胞的趋化功能。第三章在DC细胞分化和成熟过程中通过siRNA特异性抑制CCL22和CCL17的表达影响T淋巴细胞亚群的动员1.用流式细胞术分析CD11c,CD11b,CD14在MoDC,巨噬细胞和单核细胞表面的表达,及趋化因子受体CCR1,CCR2,CCR4,CCR8,CXCR3,CXCR6在CD4/CD8 T细胞表面的表达。2.用趋化因子蛋白芯片分析MoDC,巨噬细胞和单核细胞培养上清中趋化因子的广泛表达。3.用实时定量聚合酶链反应检测CCL22,CCL17,CCL2基因在巨噬细胞,MoDC和单核细胞中的表达及siCCL22,siCCL17对其调节作用。4.用酶联免疫吸附试验（ELISA）测量CCL22,CCL17,CCL2在细胞培养上清中的表达水平。5.用体外趋化实验检测siCCL22/siCCL17转染的MoDC对CD4/CD8 T细胞及Treg的趋化功能。6.建立人乳腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,体内检测siCCL22/siCCL17转染的MoDC对CD4/CD8 T细胞及Treg的趋化功能。注:统计分析:所有数据采用SPSS 11.5统计软件进行统计处理,实验数据用均数±标准差（（?）±s）表示,组间比较在有多种影响因素时采用析因分析,在只有一种影响因素时采用单因素方差分析;两组间比较采用独立样本t检验法进行分析,多组间两两比较在方差齐性时采用LSD法,方差不齐时采用近似F检验（Welch方法）及多重比较的Dunnett’s T3方法;P<0.05时有统计学意义。研究结果第一章SiMAML1通过上调黑色素瘤细胞TweakR的表达诱导CCL2的产生1.SiMAML1增加TweakR和CCL2的基因表达和蛋白生产SiMAML1成功转染黑色素瘤细胞系M624后,实时定量聚合酶链反应显示:与对照siRNA相比,siMAML1几乎完全抑制了MAML1 mRNA的转录。Western—blot检测,与对照肌动蛋白相比,MAML1蛋白翻译表达也被特异性抑制了。Notch下游Heyl的基因表达和蛋白生产也被特异性抑制了。实时定量聚合酶链反应显示SiMAML或siHeyl成功转染黑色素瘤细胞系M624后TweakR基因转录增强,流式细胞术分析发现TweakR蛋白受体在细胞表面的表达也显著增强。实时定量聚合酶链反应同时显示黑色素瘤细胞系M624被siMAML1或siHeyl转染72小时后,与对照siRNA相比,siMAML1和siHeyl显著上调CCL2 mRNA的转录,ELISA检测证实,CCL2蛋白因子在细胞培养上清的表达也显著增强。2.外源性Tweak刺激CCL2的生产外源性Tweak剂量和时间依赖性地刺激黑色素瘤细胞系M624和siMAML1转染后的黑色素瘤细胞系M624 CCL2的生产,应用anti-TweakR封闭抗体阻断Tweak-TweakR,却几乎完全抑制了外源性Tweak对CCL2的诱导产生,证明Tweak刺激CCL2生产需要Tweak—TweakR的交连。3.SiMAML1增加依赖于CCL2的单核细胞迁移趋化实验进一步研究M624生产的CCL2的功能发现,经siMAML1转染的M624细胞,其培养上清对单核细胞的趋化能力显著增强（P<0.01）。随外源性重组Tweak剂量增加,被刺激的siMAML1转染的M624细胞的培养上清对单核细胞的趋化能力显著增强。用抗体封闭CCL2的功能,严重阻断Tweak刺激上调的siMAML1转染的细胞诱导的单核细胞的迁移,证明siMAML1转染的M624对单核细胞迁移的趋化诱导能力依赖于CCL2.第二章LPA提高LPS刺激巨噬细胞产生CXCL16及调节细胞移动功能的研究1.巨噬细胞和MoDC细胞表面表达LPA受体流式细胞术分析显示巨噬细胞和MoDC细胞表面表达LPA受体1（LPA1）和LPA受体2（LPA2）,但没有LPA受体3（LPA3）。定性RT-PCR确证巨噬细胞/MoDC细胞,象他们的前体细胞CD14⁺单核细胞一样,表达LPA受体1（LPA1）和LPA受体2（LPA2）mRNA,只有MoDC细胞表达低水平的LPA受体3（LPA3） mRNA。2.巨噬细胞和MoDC细胞表面表达CXCL16流式细胞术分析显示巨噬细胞和MoDC细胞表面表达CXCL16,少数单核细胞表面表达CXCL16。几乎所有经单核细胞分化来的巨噬细胞获得CXCL16,而MoDC细胞表面表达最高水平的CXCL16。ELISA法测定巨噬细胞和MoDC分泌可溶性CXCL16,上述MoDC细胞表面表达最高水平的CXCL16相对照,而巨噬细胞释放更多的CXCL16到培养上清液。3.LPA增加巨噬细胞中CXCL16的生产和脱落用LPS刺激巨噬细胞以诱导趋化因子的释放,ELISA法检发现,LPA大大增加CXCL16在巨噬细胞的生产和释放,其水平超过对照LPS组2倍以上。然而流式细胞术分析显示LPA并不导致CXCL16在巨噬细胞表面的表达增强。定量实时RT-PCR显示LPA也上调CXCL16 mRNA在巨噬细胞的表达超过64倍。4.LPA刺激巨噬细胞CXCL16脱落的信号传递途径作为特定的G_i/o受体蛋白,Rho及NFkB通路抑制剂,ELISA分析显示PTx,exoC3,PDTC均能显著降低LPA刺激诱导的CXCL16蛋白的生产（P<0.01）,这表明LPA刺激诱导的CXCL16蛋白的生产需要G_i/o,Rho,NFkB通路的活化。RT-PCR检测证实LPA刺激诱导的CXCL16 mRNA的表达也依赖于G_i/o,Rho,和NFkB通路的调节。5.LPA增加巨噬细胞的趋化活性趋化实验结果显示,经LPA/LPS刺激的巨噬细胞培养上清对CD3⁺T细胞的趋化能力显著增强（P<0.01）,然而经CXCL16阻断抗体预处理过的培养上清液对CD3⁺T细胞的趋化能力显著降低（P<0.01）,与此同时,正常鼠对照抗体IgG没有影响LPA/LPS刺激的巨噬细胞培养上清对CD3⁺T细胞的趋化能力（>0.05）,这意味着LPA介导的巨噬细胞对CD3⁺T细胞的趋化能力增强是通过增加可溶性CXCL16的生产。与上述ELISA试验结果显示的LPA刺激CXCL16生产通过G_i/o,Rho和NFkB几个信号转导通路的活化相似,LPA增强的巨噬细胞对CD3⁺T细胞的趋化能力也需要G_i/o,Rho和NFkB通路的活化。第三章在MoDC细胞分化和成熟过程中通过siRNA特异性抑制CCL22和CCL17的表达影响T淋巴细胞亚群的动员1.MoDC表达的趋化因子与单核细胞不同由PBMC纯化的CD14⁺细胞在培养基中单独培养,或加GM-CSF和IL-4培养MoDC,或加LPS或其他的复合细胞因子诱导MoDC成熟,获得的细胞具有不同细胞的典型形态。MoDC表达共刺激分子CD86,CD40和HLA-DR,但失去了CD14抗原。趋化因子蛋白芯片定性检测发现:单核细胞表达大量的CCL27,CXCL16,CXCL5,CCL24,CXCL3,CXCL8,CCL2,CCL4,CXCL7和CCL18,少量的CXCL1,CCL3和CCL8;MoDC与单核细胞相比,不同之处在于不表达CCL8,高表达CCL17,CCL22和CCL23。ELISA法定量测定和实时定量聚合酶链反应显明与单核细胞相比,MoDC分泌高水平的CCL22,CCL17,CCL23。2.MoDC和单核细胞分泌的趋化因子对活化的T淋巴细胞的趋化能力不同MoDC的培养上清对CD4⁺和CD8⁺效应淋巴细胞的趋化能力显著高于单核细胞（P<0.01）,但对静止细胞的趋化能力相对较小（0.01<P<0.05）。单核细胞的条件培养基对CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞的趋化功能相同,但MoDC对CD4⁺效应淋巴细胞的趋化功能较对CD8⁺效应淋巴细胞强。由于自单核细胞分化和成熟过程中MoDC增强表达趋化因子（CCL17,CCL22,CCL23）,分析其相应受体CCR1（CCL23受体）,CCR4（CCL17受体）,CCL22受体),CCR8（CCL17受体）与CCL2（CCL2受体）、CXCR6（CXCL16受体）在CD3⁺淋巴细胞的表达情况显示,CD4⁺淋巴细胞表达的CCR4较高,CD8⁺淋巴细胞主要表达CCR2和CXCR6。这些结果提示,激活的CD4⁺淋巴细胞可能根据他们表达的CCR4向CCL17和CCL22梯度方向运动,而CD8⁺淋巴细胞主要是根据在巨噬细胞和DC分化过程中形成的CCL2和CXCL16梯度移动。MoDC的培养上清对CD25⁺Foxp3⁺CD4⁺Treg的吸引作用明显强于单核细胞的培养上清。3.抗体阻断CCL22和CCL17能调节MoDC动员CD4⁺/CD8⁺比率和Treg的频率将MoDC与抗-CCL2,抗-CCL17,anti-CCL22,anti-CCL23,或相应非特异抗体对照作用后,趋化实验分析发现:阻断CCL2对CD4⁺/CD8⁺Treg的移动频率几乎没有影响（P>0.05）,但是阻断CCL17和CCL22显著地降低CD4⁺/CD8⁺比率和Treg的移动频率（P<0.05:P<O.01）,并意外地发现,阻断CCL23增加CD4⁺/CD8⁺比率和Treg的移动频率。4.用siRNA特异性的抑制CCL22和CCL17的表达可以调节CD4⁺/CD8⁺比率和MoDC动员Treg的频率应用CCL17和CCL22特异性siRNA转染后沉默了CCL17和CCL22基因和蛋白的表达,体外趋化实验分析发现其结果显著地降低CD4⁺/CD8⁺比率和Treg的移动频率（P<0.05）。5.体内瘤内注射siCCL22和siCCL17转染的MoDC招募更少Tregs但更多CD8⁺T细胞当人类乳腺癌细胞株于裸鼠长成实体瘤时,对照MoDC或经siCCL22和siCCL17转染的MoDC被注入肿瘤体内后,实时定量荧光RT-PCR和ELISA法证实,在这些siRNA转染的MoDC中,瘤体内5-7天内CCL22和CCL17几乎被完全抑制了,体外筛选的Tregs和激活CD8⁺T细胞混合液也被注入肿瘤体内。48小时后,手术摘取瘤体,经分离消化获得单个细胞悬液。流式细胞仪分析显示,与对照组MoDC相比,siCCL22和siCCL17转染的MoDC,显著招募更多的CD8+T细胞（10.5%比3.56%）和更少Tregs（0.24%比4.59%）。上述肿瘤样本经免疫组织化学染色证实,瘤体内存在相同数量的CD11c⁺MoDC,而经siCCL22和siCCL17转染的MoDC周围存在更多的CD8⁺T细胞和更少Tregs共存。结论:1.SiMAMLI通过上调黑色素瘤细胞TweakR的表达诱导CCL2的产生Notch信号传递途径在黑色素细胞中的高表达和天然活化,导致其下游转录抑制因子Heyl的转录和激活,后者抑制rweakR在细胞表面的表达而抑制CCL2的表达和分泌,因此降低免疫细胞在黑色素瘤肿瘤微环境的正常入侵和免疫监视,表明Notch信号传递途径代表肿瘤细胞摆脱自然免疫监视分子机制之一。siMAML1特异性阻断Notch信号传递途径下游的转录信号,增加TweakR表达,扩增了Tweak-TweakR之间的相互作用,诱导CCL2表达和自然免疫细胞的浸润。因此,针对Notch信号传递途径的siMAML1应作为一种探索治疗肿瘤的免疫治疗策略。2.LPA提高LPS刺激巨噬细胞产生CXCL16及调节细胞移动功能的研究LPA显著地增加巨噬细胞经LPS刺激产生的CXCL16。经LPA处理后,巨噬细胞/MoDe分泌产生的可溶性CXCL16对活化T细胞也具化学吸附能力。LPA不仅能增加其他炎性细胞因子的产生和脱落,也增加CXCL16的产生和脱落,进而引导更多的活化T细胞到炎症和肿瘤局部,发挥功能性免疫反应。因而LPA上调巨噬细胞和MoDC表达CXCL16,最有可能趋化诱导炎症和肿瘤部位的Thl和功能性细胞毒性效应。LPA和趋化因子之间的有机联系会促进我们对脂质介导的免疫反应的认识。3.在DC细胞分化和成熟过程中通过siRNA特异性抑制CCL22和CCL17的表达影响T淋巴细胞亚群的动员来自单核细胞的不同分化阶段的MoDC产生的趋化因子的高低不一,MoDC与巨噬细胞一样,产生一系列的T效应细胞趋化因子（高表达CCL2,CCL4,CXCL16）和Treg趋化因子（高表达CCL22,CCL17）。用siRNA特异性阻断CCL22和CCL17的转录表达,可有效地减少Treg的趋化移动频率,而吸引更多的T效应细胞到肿瘤部位去杀伤肿瘤细胞,为DC疫苗治疗肿瘤提供一种新思路。总之,siRNA或LPA调节肿瘤微环境中多种细胞（包括肿瘤细胞,巨噬细胞和DC等）来源的多种趋化因子（CCL2,CXCL16,CCL22/CCL17,et al.）的表达和功能,可有效地诱导自然免疫巨噬细胞本身和后天免疫T细胞移动到炎症及肿瘤反应部位,从而调控肿瘤免疫反应,为优化肿瘤免疫治疗提供了新思路。