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目的:对Sprague-Dwley(SD)大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)进行体外抽提,并进行分离、培养、纯化,对生物学特性进行鉴定。用绿色荧光蛋白(Green Fluorenscent Protein,GFP)标记慢病毒载体进行体内示踪。观察BMSCs移植治疗大鼠横纹肌溶解致急性肾损伤(Rhabdomyolysis-induced AKI,RIAKI)的可行性,评价其对RIAKI大鼠肾脏形态结构、功能的影响,并从细胞水平观察BMSCs治疗RIAKI的效果。观察BMSCs移植后RIAKI大鼠Th17细胞及Treg细胞变化及炎症介质水平变化,探讨BMSCs治疗横纹肌溶解致急性肾损伤的机制。方法:1、无菌条件选取健康雄性SD大鼠双后肢的骨髓细胞,采用密度梯度离心法体外分离、培养BMSCs并传代,保存P2~P6代BMSCs,治疗时用P3代BMSCs。流式细胞仪检测细胞表面标志分子及生物学性质,包括生长曲线及细胞周期分析。细胞化学法鉴定BMSCs的多向分化潜能。BMSCs慢病毒载体介导GFP标记和扩增,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)(5、10、25、50)进行感染,得到最佳感染效率和细胞活性。2、BMSCs移植治疗RIAKI大鼠效果:⑴成年健康雄性SD大鼠禁水24h后,双后肢肌内注射50%甘油(生理盐水稀释)10ml/Kg制作RIAKI大鼠模型。⑵将SD大鼠随机分为4组:正常对照组(Normal组);假手术组(NS组);模型组(RIAKI组);治疗组(BMSCs组)。分别观察各组大鼠一般情况;血清生化指标:尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、肌酸激酶(CK);形态学与病理学改变:双后肢肌肉(HE染色);肾(HE、PAS染色);肾脏细胞凋亡(TUNEL凋亡分析,Western Blot检测肾组织caspase3,caspase 9,Bcl-2,cytochrome C蛋白表达)。3、BMSCs移植治疗大鼠RIAKI作用机制:⑴细胞水平:流式细胞技术检测各组大鼠脾脏组织中Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)在CD4+T细胞中的比例及Th17细胞(CD4+、IL-17+代表Th17)比例。⑵基因水平:RT-PCR检测各组大鼠脾脏及肾组织Th17细胞特异性转录因子RORγtm RNA及Treg细胞特异性转录因子Foxp3m RNA水平⑶特异性细胞因子水平:ELISA检测各组大鼠血清及肾组织中Treg细胞释放的特异性细胞因子:TGF-β、IL-10(抗炎);Th17细胞释放IL-17(促炎);相关炎性细胞因子TNF-α、IL-6的水平。结果:1、采用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法所培养的BMSCs呈长梭形,胞核位于中央,呈圆形或椭圆形。流式细胞检测结果为:BMSCs均表达CD44,CD90,阳性率分别为89.9%,91.3%;而CD45,呈阴性,阳性率分别为2.8%。从传代细胞生长曲线可见:第1~2d为细胞生长潜伏期,第3~7d为对数生长期,7d后进入平台期。感染复数(multiplicity of infection,MOI)=25时高表达绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下绿色荧光明显可见,细胞生长速度快,BMSCs-GFP>90%,本实验最佳MOI确定为25。2、生化指标变化:RIAKI组大鼠后肢甘油注射后血BUN、Scr和CK显著升高,第6h、24h、48h、72h、96h及1W(周)后与干预前及Normal组比较差异显著(P<0.01),其中血BUN、SCr于第72h达峰值,CK于第24h达峰值,上述生化指标升高水平及变化趋势符合横纹肌溶解并急性肾损伤的实验室诊断标准。BMSCs组血BUN、Scr水平于第24h、48h、72h、96h及1W较RIAKI组相同时间点降低,差异显著,有统计学意义(P<0.01)。BMSCs组第24h、48h、72h、96h肌肉组织损伤指标血CK值较RIAKI组相同时间点降低,差异显著,有统计学意义(P<0.01)。NS组与Normal组两组间各指标比较无统计学意义(P>0.05)。光镜下可见RIAKI组及BMSCs组大鼠双后肢局部肌肉组织呈肌溶解性病理改变,BMSCs组大鼠24h、48h、72h横纹肌溶解损伤程度较RIAKI组明显减轻,BMSCs组大鼠24h、48h、72h肾组织损伤程度较RIAKI组减轻,表现为肾小管内管型减少,上皮细胞坏死程度减轻。TUNEL法检测细胞凋亡情况,荧光显微镜观察BMSCs组较RIAKI组第24h、48h、72h、1w大鼠肾脏凋亡细胞减少,凋亡指数(AI)降低(P<0.01)。WB检测结果显示Normal组及NS组caspase 3、caspase 9、cytochrome C蛋白极低水平表达,Bcl-2蛋白表达水平较高。BMSCs组第24h、48h、72h、1w各时间点caspase 3、caspase 9、cytochrome C蛋白含量与均低于RIAKI组表达水平(P<0.05),BMSCs组各时间点Bcl-2蛋白表达水平均高于RIAKI组(P<0.05)。3、流式技术检测大鼠脾脏Treg细胞比例变化,结果显示BMSCs组与RIAKI组比较第24h、48h、72h Treg细胞比例升高,Th17细胞比例降低,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测RORγt m RNA和Foxp3 m RNA的表达发现BMSCs组与RIAKI组比较脾脏及肾组织RORγt m RNA水平下调,Foxp3m RNA水平上调,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测血清及肾组织细胞因子IL-17、IL-10、TGF-β、IL-6和TNF-α的含量发现:BMSCs组与RIAKI组比较IL-17水平下,L-10水平升高,TGF-β水平升高,IL-6、TNF-α水平降低,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。结论:1、通过密度梯度离心法联合BMSCs贴壁筛选法可获得足量纯化的BMSCs,GFP慢病毒载体成功转染BMSCs,并高效的表达GFP,不影响BMSCs生长、分化等生物学特性及功能,可作为移植BMSCs细胞标记示踪的手段。2、双后肢肌肉注射50%甘油溶液可成功诱导了RIAKI大鼠模型,BMSCs治疗降低RIAKI大鼠的血BUN、SCr和CK水平,在一定程度上改善了急性损伤肾脏的结构与功能,证实了BMSCs对RIAKI治疗效果;进一步从细胞水平观察发现BMSCs治疗可减少RIAKI大鼠肾脏凋亡细胞数量,降低凋亡指数。BMSCs移植上调RIAKI大鼠肾组织抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制促凋亡因子cyt C释放,下调凋亡效应因子caspase-9、caspase-3表达,BMSCs抑制肾脏细胞凋亡可能是通过使细胞凋亡通路中线粒体途径受抑,从而发挥肾保护作用。未发现BMSCs在肾脏的定植,推测BMSCs可能通过“非分化修复”的旁分泌及免疫调节等减轻RIAKI。3、在第二部分实验基础上进一步研究BMSCs改善RIAKI的“非分化修复”机制,结果证实RIAKI大鼠机体存在Thl7/Treg细胞免疫失衡及其特异性、炎性细胞因子水变化,机体存在促炎-抗炎反应失衡。BMSCs治疗可上调Treg细胞比例,在基因水平下调Th17细胞特异RORγtm RNA表达,促进Treg细胞特异性转录因子Foxp3m RNA上调;BMSCs抑制Thl7细胞特异性促炎性细胞因子IL-17的表达,促进Treg细胞因子抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β的表达,同时抑制炎性效应因子IL-6、TNF-α表达,从而验证了BMSCs可以调节RIAKI大鼠体内Thl7/Treg细胞免疫失衡、抑制炎症反应,这可能是BMSCs减轻横纹肌溶解致急性肾损伤程度,发挥肾保护作用的重要机制。