中药穿山甲是药用野生动物中华穿山甲生甲片的炮制品,具有重要的药用价值。随着中华穿山甲数量的不断萎缩,合法原料不断减少,穿山甲药材市场上出现了众多混伪品与掺假品,给临床用药安全带来了风险。经典的性状检测法鉴别穿山甲药材存在一定局限,因此,有必要建立一种快速准确的鉴别方法。DNA条形码技术是利用一段特定的DNA序列对物种进行准确鉴定,在其基础上发展起来的DNA微型条形码技术以及结合克隆测序的条形码技术,近年来被分别用于降解样品和混合样品的物种鉴定研究中,这些新兴的分子鉴定技术为穿山甲药材的鉴定提供了新思路。本研究拟采用DNA条形码技术对穿山甲生甲片、炮制甲片及其混伪品进行鉴定。首先,DNA提取是开展条形码分子鉴定工作的前提,穿山甲甲片质地坚硬,不易破碎释放DNA,其次炮制甲片DNA发生降解,含量较低。因此,本研究对穿山甲甲片样品DNA提取过程中的细胞裂解与DNA吸附阶段进行了优化,发现采用蛋白酶K搭配高效裂解液RLY酶解1 h联合磁珠吸附法可以获得高得率的基因组DNA,为后续鉴定工作提供了基础。本研究分别选取线粒体细胞色素C氧化酶I(COI)、线粒体16S rRNA和12S rRNA、线粒体细胞色素b(Cyt b)、核糖体DNA第二内转录间隔区(ITS2)基因的部分片段作为标准条形码(500～1000 bp左右),利用相应的引物对穿山甲药材及其混伪品的DNA进行PCR扩增,Sanger测序后进行序列分析。结果显示,16S rRNA基因的16S(16H1/16L1)引物对生甲片DNA的扩增能力较炮制甲片强,扩增序列能鉴别出中华穿山甲,说明DNA标准条形码技术适用于鉴别中华穿山甲生甲片,但是不易鉴别炮制甲片。由于炮制甲片难以扩增出标准条形码序列,本研究选取了序列长度相对较短的DNA微型条形码(100～300 bp左右)进行了检测,结果显示,基于16S rRNA和12S rRNA基因的16S(L2513/H2714)和12S(L1085/H1259)引物在生甲片和炮制甲片DNA中均能扩增成功,扩增序列能鉴别出中华穿山甲,说明DNA微型条形码技术适用于中华穿山甲生甲片和炮制甲片的鉴别。为模拟穿山甲药材掺假现象,本研究制备了中华穿山甲与其它动物炮制甲片的混合样品,采用16S(L2513/H2714)和12S(L1085/H1259)微型条形码引物并结合克隆测序技术,检测出了混合样品中的物种组成,这表明DNA条形码结合克隆测序技术在鉴定复方或复杂药材方面具有可行性。本研究建立了适用于中华穿山甲生甲片、炮制甲片及其混伪品的DNA标准条形码和微型条形码鉴定技术,同时探索了DNA条形码结合克隆测序技术对穿山甲药材掺假品的鉴定能力。这些结果不仅能为穿山甲药材提供快速准确的鉴别方法,也可为临床用药安全提供保障。