山楂果肉原花青素的分离、鉴定与生物活性研究

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山楂是一种在我国广泛分布的蔷薇科植物,是一种集食品营养价值及药用价值为一身的保健水果,含有多种具有生理活性的化学成分,其中的原花青素具有很强的抗氧化性。原花青素(Proanthocyanidin,简称PC)是多酚类物质,具有高度羟基化的结构,能够起到抗氧化、清除自由基、抑菌等作用,有很好的开发利用价值。(1)本研究首先测定山楂叶子与果肉中蛋白质、总糖、总酸、总多酚、总黄酮和原花青素等主要化学成分的含量,并将不同品种山楂果肉中原花青素的含量作一比较,结果表明山东平邑县所产新品系“超金星”山楂果肉中原花青素的含量较高,很有研究意义,所以确定为实验材料。(2)对HSPC的提取工艺进行了初步探讨,通过单因素实验,在中心组合实验基础上,运用响应面分析法得出了提取HSPC的最佳工艺组合:温度80.66℃,时间90.17min,乙醇浓度68.11%,pH5,料液比1∶12,提取2次。在此条件下HSPC的平均提取率可达95.9%。采用固相萃取的方法对山楂果肉提取物中原花青素进行了纯化,产物纯度为82.69%,原花青素的得率为3.36%;并采用乙酸乙酯萃取法和石油醚沉淀法进一步对固相萃取后的HSPC粗提物(PCI)进一步纯化。结果表明,乙酸乙酯萃取和石油醚沉淀的分离效果明显,并由此得到了四种不同类型的HSPC提取物,即乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯萃取水相提取物、石油醚沉淀物和石油醚沉淀水相提取物。乙酸乙酯萃取物(PC2)纯度达75.31%,得率为1.98%;乙酸乙酯萃取水相提取物(PC3)纯度达81.22%,得率为1.63%;石油醚沉淀水相提取物(PC4)纯度达82.19%,得率为2.98%;石油醚沉淀物(PC5)纯度达62.13%,得率为0.42%。(3)通过对五种不同类型HSPC进行的UV、m光谱分析,通过UV光谱图,可以确定HSPC的特征吸收峰在280nm处,与葡萄籽原花青素标品的UV光谱吸收一致;通过IR光谱图,证实了HSPC的基本骨架结构,与葡萄籽原花青素标品结果基本一致。综上所述,可以初步判断HSPC各提取物中的主要成分为不同聚合度的原花青素混合物。通过对五种不同类型HSPC进行的HPLC色谱分析,参照标品HPLC色谱图,可以得出山楂果肉中含有山楂果肉中含有多种原花青素低聚体,且乙酸乙酯萃取对HSPC粗提物的分离效果要优于石油醚沉淀,乙酸乙酯萃取相能够集中大部分的原花青素低聚体。HPLC-MS进一步证实了乙酸乙酯萃取相HSPC含有多种原花青素单体和低聚体,具有开发利用价值。通过对乙酸乙酯萃取物酸水解产物的高效液相色谱分析,证明山楂果肉中原花青素聚合体末端单元由(-)-Epicatechin组成。(4)通过体外实验研究了不同提取物的油脂抗氧化、清除自由基活性和抑菌活性。①油脂抗氧化结果表明山楂果肉PC具有较强的抗氧化能力,0.04%原花青素的抗氧化活性与0.02%BHT的抗氧化效果相近,0.02%原花青素的抗氧化活性优于0.02%茶多酚、0.02%VC、0.02%柠檬酸和0.02%酒石酸,VC、柠檬酸、酒石酸对原花青素的抗氧化作用均有不同程度的协同效应。②化学发光法测定山楂果肉原花青素乙酸乙酯萃取物的体外抗氧化活性及其对DNA损伤的保护作用。结果表明,当HSPC浓度为1mg/mL时,对超氧阴离子抑制率达87.7%,其半数抑制率浓度IC50值为130.8μg/mL;100μg/mL时对羟基自由基抑制率达91.7%,IC50值为61.73μg/mL:8μg/mL时对双氧水抑制率达91.6%,IC50值为0.19μg/mL;40μg/mL时对体外DNA损伤抑制率达80.7%,IC50值为22.16μg/mL。表明HSPC具有很好的体外清除活性氧和保护DNA损伤的活性。③抑菌实验结果表明:各产物对细菌都有不同程度的抑制作用,其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好,而对霉菌和酵母菌几乎无抑制作用。各级分之间相比,其中PC1、PC2和PC4对细菌的抑制效果较好,这可能与各产物的成分有关。温度和pH值对抑菌活性有较大影响,低温处理和微碱性条件有利于抑菌活性的发挥。但各级份中的有效成分还有待于进一步的深入研究。
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