高钙离子诱导人肾小管上皮细胞自噬对炎症因子生成的影响

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目的:观察高钙离子诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)发生细胞自噬对细胞炎症因子MCP-1及HMGB1生成的影响。方法:体外培养HK-2细胞,分别用正常培养液(含0 mmol/L Ca2+液)、5 mmol/L Ca2+溶液、10 mmol/L Ca2+溶液进行处理12h,以及用10 mmol/L Ca2+液各处理0h、6h、12h,之后采用Western blot检测自噬标记蛋白(LC3B-II/LC3B-I比值)和自噬相关因子Beclin1的表达水平,实时定量PCR(RT-PCR)方法检测细胞炎症因子HMGB1及MCP-1的表达水平。同时,利用不同浓度的细胞自噬抑制剂3-MA和氯喹(CQ)分别预处理HK-2细胞6小时,随后再用上述3个浓度梯度的Ca2+溶液处理HK-2细胞12h,采用RT-PCR检测细胞自噬对炎症因子HMGB1及MCP-1表达的影响。另外,HK-2细胞分别用3个浓度梯度CQ(10 umol/L,20 umol/L,30 umol/L)预处理6h,再用10mmol/L Ca2+培养液处理12h,MTT法检测各组细胞的细胞抑制率。结果:1.高钙液处理诱导HK-2细胞自噬不同浓度Ca2+液处理的HK-2细胞内LC3B-II/LC3B-I蛋白的表达相对水平的比值分别为1.00±0.34,2.10±0.10,3.89±0.21,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05);Beclin1的相对表达水平分别为1.00±0.06,2.12±0.17,3.28±0.29,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。10mmol/L Ca2+液处理的不同时间段HK-2细胞内LC3B-II/LC3B-I蛋白的表达相对水平的比值分别1.00±0.12,3.06±0.24,4.24±0.28,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05);Beclin1的相对表达水平分别为1.00±0.15,2.58±0.30,3.55±0.37,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.高钙液处理HK-2细胞上调MCP-1、HMGB1的表达不同浓度Ca2+液处理的HK-2细胞内MCP-1 mRNA相对表达水平分别为:1.00±0.31,3.27±0.46,4.65±0.23,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05);HMGB1 mRNA相对表达水平分别为:1.00±0.05,1.34±0.20,1.56±0.16,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。10mmol/L Ca2+液处理的不同时间段HK-2细胞内MCP-1 mRNA相对表达水平分别为:1.00±0.10,2.67±0.05,4.29±0.27,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05);HMGB1 mRNA相对表达水平分别为:1.00±0.07,1.30±0.19,1.67±0.24,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.自噬抑制剂对高钙离子环境刺激下HK-2细胞MCP-1和HMGB1表达的影响(1)自噬抑制剂上调高钙离子处理HK-2细胞内MCP-1的表达CQ或3-MA预处理后,不同浓度高Ca2+液诱导的HK-2细胞内MCP-1mRNA的相对表达水平的分别为:CQ预处理:1.00±0.12,0.32±0.03,0.41±0.15,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05);3-MA预处理:1.00±0.09,0.58±0.12,0.60±0.06,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度的CQ预处理后,高钙液处理细胞内MCP-1 mRNA相对表达水平分别为:1.00±0.11,0.77±0.15,0.46±0.09,0.30±0.11,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。(2)自噬抑制剂对高钙离子处理HK-2细胞内HMGB1的表达无显著影响CQ或3-MA预处理后,不同浓度高Ca2+液诱导的HK-2细胞内HMGB1mRNA的相对表达水平分别为:CQ预处理:1.00±0.14,1.26±0.17,1.13±0.21,各组间比较差异无统计学意义(P>0.05);3-MA预处理:1.00±0.09,0.96±0.12,1.16±0.10,各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同浓度的CQ预处理后,高钙液处理HK2细胞内HMGB1 mRNA相对表达水平分别为:1.00±0.09,1.09±0.14,1.13±0.17,1.04±0.21,各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.自噬抑制剂改善高钙离子处理HK2细胞的活性不同浓度CQ预处理后,10mmol/L Ca2+离子液处理的细胞抑制率的值分别为:(52.0±3.40 vs 43.0±6.30)%,(50.0±4.20 vs 33.0±7.30)%,(48.0±3.60vs 24.0±4.12)%,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究结果提示,在高钙离子环境下,HK-2细胞自噬与炎症因子的表达有关。高钙离子诱导肾小管上皮细胞自噬可能是参与结石形成的潜在机制之一。
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