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目的:肥胖是指体内脂肪堆积过多和(或)分布异常,是在遗传背景下的能量摄入和消耗失衡的结果,肥胖与高血压和糖尿病等代谢性疾病密切关联,成为当今社会非常严峻的公共健康问题。肥胖发生的根本原因是脂肪细胞体积变大和数量增多,而后者很大程度上是由于脂肪分化异常所致,所以探讨脂肪分化的分子机制从而调控脂肪细胞的数量,对于预防和治疗肥胖及相关疾病有重要意义。脂肪分化经历两个阶段:首先为定向阶段,间充质干细胞定向为前脂肪细胞;然后为终末分化阶段,前脂肪细胞终末分化为成熟脂肪细胞。调控脂肪分化最关键的因子为细胞核过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ),它具有脂肪组织特异性,在从分化的启动到成熟脂肪细胞的形成过程中,表达呈持续上升,故PPARγ成为成脂检测的标志性分子。目前关于脂肪分化的研究多以小鼠3T3-L1前脂肪细胞为模型,在终末分化阶段进行研究,关于以脂肪干细胞为模型探讨成脂的研究还非常有限。所以,本课题选用人脂肪间充质干细胞(human adipose derived stromal cells,h ADSCs)进行脂肪分化研究,比小鼠3T3-L1细胞更接近人的生物学状态,对疾病的预防、治疗更加具有指导意义。目前,常用的成脂诱导剂为胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)三者的联合使用。但是IBMX属于化学制剂,不能很好地代表体内脂肪分化的诱导因素。肥胖和高脂饮食密切相关,而油酸(oleic acid,OA)是动物油和植物油中常见的游离脂肪酸(free fatty acid,FFA),也是血液FFA含量最多的成分,故将其替代IBMX进行成脂诱导,可在一定程度上模拟人体的生理作用模式。p62是一种多功能蛋白,参与泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体两种蛋白降解过程,泛素化蛋白可与p62 C端的泛素相关结构域结合形成聚集体,经泛素蛋白酶体系统降解;另外也可通过LC3交联域靶向LC3,经自噬-溶酶体系统降解。故p62是两个系统重要的中介分子。p62在肿瘤领域研究较多,关于p62与肥胖发生的报道,主要是关于其参与调节能量代谢方面,2011年《cell》杂志报道p62基因敲除的小鼠发生了肥胖和胰岛素抵抗,白色脂肪组织中脂肪积累增加,基础脂水解变慢,脂肪内脂质的合成增加。p62是否通过调节脂肪细胞的分化而影响肥胖的发生,目前还未见报道。自噬是真核细胞通过溶酶体清除异常蛋白和受损细胞器的主要方式之一,对维持细胞内环境稳态起着关键作用。自噬以细胞内双层膜样结构包裹底物形成约为1μm囊泡样的自噬体为形态学特征。基本过程包括自噬启动、自噬泡膜闭合形成自噬体、自噬体与溶酶体融合、底物在溶酶体内的降解。LC3是自噬泡形成的关键分子,作为检测自噬发生的标志物。研究报道,在自噬启动后,p62可与待降解物质结合为聚合体,介导底物进入与自噬泡膜进行结合,从而形成自噬体被转运至溶酶体进行降解,与此同时p62也在溶酶体被降解,所以p62既可以介导自噬的发生,同时也是自噬降解的底物。鉴于p62在自噬系统中的重要作用,本课题将探讨p62与自噬在h ADSCs成脂过程中的作用及二者间的联系。线粒体自噬是一种选择性自噬,即自噬泡膜上有识别受损线粒体的特异受体,并对其针对性地进行降解,这对于维持线粒体正常的数量和功能非常重要。脂肪分化过程中伴随着脂滴的形成及甘油三酯的合成,而线粒体是脂肪酸氧化的核心场所,所以在明确自噬在h ADSCs成脂过程中的基本作用后,本课题将进一步探讨线粒体自噬与p62在h ADSCs成脂中的作用及关系,为更深入地阐明人脂肪分化的分子机制,寻找新药的作用靶点提供新思路。本课题从人大腿部吸脂术抽取的脂肪组织,分离培养h ADSCs,以其作为细胞模型,采用油酸模拟生理刺激因素进行脂肪诱导。构建p62 sh RNA慢病毒载体,观察p62缺失对h ADSCs自我复制能力以及成脂能力的影响,并探讨p62是否可通过自噬或线粒体自噬途径影响h ADSCs的成脂作用。研究方法:1、从人大腿部吸脂术所抽取的脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化,分离培养h ADSCs,并进行鉴定。免疫荧光染色法检测细胞表面分子CD49d、CD105、CD31和CD34的表达;采用胰岛素、地塞米松和IBMX三联诱导法诱导h ADSCs的脂肪分化,并进行油红O染色;采用b FGF和维甲酸进行h ADSCs的成神经诱导,证明h ADSCs具有多向分化潜能。2、采用50μM、80μM和100μM三种浓度的油酸联合胰岛素和地塞米松诱导h ADSCs的成脂作用,观察细胞成脂情况:油红O染色,Western-Blot检测成脂标志分子PPARγ蛋白的表达,筛选油酸的最佳诱导浓度。3、shp62对h ADSCs自我更新能力的检测:CCK-8实验绘制细胞生长曲线。4、观察shp62对h ADSCs成脂的影响。5、观察h ADSCs脂肪分化中的自噬现象:通过免疫荧光染色检测自噬标志分子LC3点状聚集情况,Western-Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ。6、观察10m M 3-MA于成脂全程、早期、中期和末期抑制自噬对h ADSCs成脂能力的影响。7、观察p62缺失与自噬在h ADSCs成脂中的关系:MDC染色检测自噬体的形成情况;Western-Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ;3-MA抑制shp62自噬,甘油三酯定量及实时定量检测PPARγ分析成脂程度。8、观察h ADSCs成脂中线粒体的数量变化及线粒体分裂-融合平衡:q PCR测定线粒体DNA拷贝数(Nd1基因)和Western-Blot检测线粒体膜蛋白TOM20的表达分析线粒体数量;Western-Blot检测线粒体分裂蛋白Drp-1及融合蛋白Mfn-1的表达。9、观察p62缺失与线粒体自噬在h ADSCs成脂中的关系:Mitotracker Red与LC3荧光共定位检测线粒体-自噬体复合体;分离线粒体并进行线粒体LC3与去线粒体胞浆LC3的检测;5μM Cs A抑制线粒体自噬后,Western-Blot检测PPARγ的表达分析成脂能力。结果:1、所分离原代细胞镜下观察呈典型长梭形,漩涡状排列,有极性。细胞标记分子免疫荧光染色结果为CD49d和CD105为阳性表达,而CD31和CD34呈阴性;细胞经成脂诱导后,细胞浆出现大量脂滴,并被油红O染为红色;经神经诱导后,细胞伸出细长的突起,突起之间有网状连接。2、油酸联合胰岛素和地塞米松可成功诱导h ADSCs成脂:可见细胞内脂滴形成,油红O染为红色,三种浓度以80μM浓度组油红O阳性细胞率最高,PPARγ蛋白表达最高。3、p62缺失降低了h ADSCs的自我复制能力:细胞生长缓慢,增殖速度降低。4、p62缺失促进了h ADSCs成脂:油红O阳染细胞率、脂质含量、PPARγ的m RNA水平及蛋白水平显著上升。5、h ADSCs成脂过程中发生了自噬:免疫荧光检测LC3-Ⅱ的点状聚集在未分化时(d0)较弱,于分化早期(d1-3)增加明显,之后渐减弱至分化前水平。Western-Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ于分化早期逐渐增高,之后开始下降。6、分化早期使用10m M 3-MA抑制自噬可显著降低成脂:油红O计数及PPARγ蛋白表达均降低。中期和末期抑制自噬,成脂率差异无统计学意义。结果表明,自噬主要在成脂早期起作用。7、shp62可通过增强自噬而促进成脂:shp62转染组,MDC阳染细胞数增加;Western-Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ增加;表明shp62促进成脂同时促进了自噬。使用3-MA抑制shp62增强的自噬后,甘油三酯含量和PPARγm RNA表达下降,成脂显著降低,提示shp62可通过激活自噬而促进成脂。8、h ADSCs成脂中线粒体的数量增加:Nd1基因及TOM20表达增加。h ADSCs成脂早期趋向于断裂状态的线粒体增加:Drp-1蛋白于早期增加,融合蛋白Mfn-1成脂过程中无差异。9、p62缺失可增强线粒体自噬:shp62组,荧光共定位检测线粒体-自噬体复合体增加;线粒体组分LC3表达增强;使用Cs A抑制shp62增强的线粒体自噬后,成脂的作用被抑制,表明p62缺失可通过增加线粒体自噬活性而促进成脂功能。结论:1、油酸联合胰岛素和地塞米松可诱导h ADSCs成脂;p62缺失可增强油酸诱导h ADSCs的成脂能力。2、自噬主要在h ADSCs成脂早期起作用;p62缺失可通过增强自噬而促进成脂。3、线粒体含量在h ADSCs成脂后显著增加;p62缺失可通过增强线粒体自噬促进h ADSCs的成脂。