慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD），又称“慢阻肺”是一种以呼吸道气流阻塞为特点的呼吸道疾病，病情常呈进行性发展[1]。持续且大量增长的COPD发病率和死亡率已造成了沉重的社会负担和经济负担[2,3]。COPD患者肺部的主要病症是呼吸道持续性炎症和不可逆的气流阻塞[1]。小气道气道重塑被认为是造成气道气流受限的重要原因[4-6]。小气道重塑表现为粘膜增厚，基底膜增厚以及细胞外基质蛋白过度沉积，在重症COPD患者中还观察到气道平滑肌（Airway smooth muscle, ASM）组织增生[4,5,7]。细胞外基质（Extracellularmatrix, ECM）是一个由生物大分子和蛋白水解酶相互作用而构成的复杂的网络结构，为细胞与细胞，细胞与基质之间相互作用提供平台。在肺部，细胞外基质的组成成分影响着动态网络的结构和功能。通过组织染色等研究发现，COPD患者气道细胞外基质的成分明显发生改变[8,9]。目前认为，吸烟是导致COPD发生发展的主要原因，许多研究认为COPD的典型发病原因是因为吸烟引起慢性炎症从而致使组织破坏，然而有研究表明，COPD患者气道重塑可独立于气道炎症而产生[10]。研究显示，COPD患者的成纤维细胞在受到香烟提取物（Cigarette smoke extract, CSE）的刺激之后可提高成粘连蛋白（Fibronectin, FN）和基底膜聚糖（Perlecan）的沉积量，而降低核心蛋白聚糖（Decorin）和双糖链蛋白多糖（Biglycan）等蛋白聚糖的沉积[10,11]。然而目前关于香烟对COPD气道平滑肌细胞影响的研究却较少。转化生长因子-β1（Transforming growth factor, TGF-β1）是一种促纤维化细胞因子，常常在急性或者慢性肺部疾病中表达增高，如COPD、哮喘和肺纤维化等[12-15]。TGF-β1被认为在组织纤维化的病理过程中扮演着重要的作用，可刺激多种细胞外基质蛋白的表达与分泌如纤连蛋白、基底膜蛋白和多种胶原蛋白[16-18]。扣针蛋白-1（Fibulin-1, FBLN-1）是一种分泌型糖蛋白，它与细胞外基质网络的形成和再建密切相关，与多种细胞外基质蛋白相互作用如纤连蛋白、巢蛋白以及层黏粘蛋白等[19-22]。然而目前对于FBLN-1在气道纤维化的病理机制中所起到的作用还不清楚。在本课题的研究中我们假设来自COPD患者与非COPD患者的气道平滑肌细胞在CSE或TGF-β1单独作用下，其细胞外基质基因表达趋势会明显不同，并且气道平滑肌细胞会对CSE和TGF-β1这两种刺激物产生明显不同的细胞外基质基因表达趋势。进一步，我们假设两个实验组的平滑肌细胞对气道重塑相关蛋白的表达和释放也不相同，并且对CSE刺激产生的细胞行为的反应也不相同。最后我们假设TGF-β1可促进FBLN-1在细胞外基质中的沉积，并且在COPD气道平滑肌细胞中的表达量更高。为检验以上假设，我们采用导致COPD产生的高危因素-香烟提取物（CSE），以及气道纤维化诱导因子TGF-β1作为刺激物，对体外培养的来自COPD患者与非COPD患者的气道平滑肌细胞进行了刺激。继而，检测与观察了相应的气道平滑肌细胞细胞外基质蛋白基因和细胞粘附相关基因的表达水平。在此基础上，进一步筛选并检测了部分胶原蛋白和基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）的表达情况，并检测了CSE对气道平滑肌细胞粘附和修复功能的影响。最后，我们深入探究了FBLN-1在气道纤维化中可能起到的作用。实验结果表明：1）CSE比TGF-β1上调更多细胞外基质蛋白基因和与细胞粘附相关的基因，特别是在COPD组尤为明显。使用浓度为5%的CSE或TGF-β1刺激气道平滑肌细胞之后，胶原蛋白类基因在COPD组中上调数量高于非COPD组；而MMP类基因在非COPD组中上调数量高于COPD组。10%的CSE使COPD组气道平滑肌细胞比非COPD组上调更多MMP基因。TGF-β1比5%的CSE上调更高倍数的COPD胶原蛋白基因；而5%的CSE比TGF-β1上调更高倍数和数量的非COPD的MMP基因。2）MMP在培养基上清液中的总表达检测结果显示，基质金属蛋白酶-2（MMP-2）在气道平滑肌细胞中的表达量相对于基质金属蛋白酶-1、-3、-10（MMP-1,-3,-10）更高，但是CSE和TGF-β1对其表达量没有影响。MMP-3和MMP-10的表达趋势类似，高浓度的CSE（10%）可增高气道平滑肌细胞中MMP-3和MMP-10的表达量，而TGF-β1仅增高COPD气道平滑肌细胞中MMP-3和MMP-10的表达量。CSE而非TGF-β1增高了MMP-1的表达量，并且两个实验组细胞受CSE刺激之后其MMP-1表达量有显著性差异。3）CSE或TGF-β1的刺激仅仅增高了COPD气道平滑肌细胞的胶原蛋白-8α1（Collagen VIII α1, COL8A1）在细胞外基质中的沉积。气道组织染色实验进一步证实COPD患者气道内COL8A1比非COPD患者气道内COL8A1的表达量更高。4）CSE仅仅降低COPD气道平滑肌细胞的粘附和伤口修复能力，对非COPD气道平滑肌细胞没有影响，然而TGF-β1促进COPD气道平滑肌细胞的粘附能力。5）TGF-β1降低气道平滑肌细胞分泌可溶型FBLN-1而增高细胞外基质中沉积的FBLN-1。TGF-β1可促进外源性FBLN-1沉积于细胞外基质之中。综上所述，本课题研究首次揭示了COL8A1在COPD与非COPD气道平滑肌组织中的差异和在气道平滑肌细胞中的表达差异，从而为进一步探究COL8A1在气道重塑中的作用提供了理论依据。本课题的研究也显示CSE可诱导多种MMP基因表达增高，特别是MMP-1（胶原蛋白酶）在COPD气道平滑肌细胞中表达显著高于非COPD气道平滑肌细胞，此实验结果提示MMP在肺泡组织降解中起到重要作用。在TGF-β1的诱导下，可溶型FBLN-1向细胞外基质FBLN-1转化，为我们理解细胞外基质沉积在气道纤维化中的作用提供了理论依据。本研究成果为解释COPD患者气道气流阻塞这一复杂变化提供了更清晰的理论依据。