第一部分α-Ac-Tub在人体(煤)矽肺标本中的表达及其病理学意义目的:观察与分析α-Ac-Tub在人体(煤)矽肺标本中表达及其临床病理学的意义。方法:1(煤)矽肺患者样本来自于59例尸检病例,年龄最小30岁,最大77岁,平均年龄52岁。分别来自内蒙、山西、湖南、河北等省煤矿以及水泥、陶瓷、耐火材料厂的工人(煤矿井下作业工人45例、其他作业工人14例)。其中Ⅰ期(煤)矽肺22例、Ⅱ期(煤)矽肺8例、Ⅲ期(煤)矽肺7例,(煤)矽尘性反应22例。最短接尘史7年,最长为46年,平均22年。13例对照组选取外科手术切除肺组织标本(均为年龄相近无接尘史的临床患者)。2 HE染色、Masson染色观察病理形态变化。免疫组织化学染色法用以检测肺组织中α-SMA、vimentin和α-Ac-Tub的表达情况。免疫荧光法检测α-Ac-Tub和vimentin以及α-Ac-Tub和SP-A的共定位表达情况。结果:1在人体(煤)矽肺标本中,能够较好的观察到矽肺病变发生演变的过程。既吞噬粉尘的巨噬细胞性肺泡炎---细胞性结节---细胞纤维性结节---纤维性结节(包括玻璃样变性的结节)。2α-SMA阳性标记的肌成纤维细胞定位分布于结节性病灶和弥漫性间质纤维化区域。3α-Ac-Tub可表达于正常肺组织的多种细胞(包括支气管上皮细胞、血管内皮细胞、肺泡上皮细胞和肺成纤维细胞等)。在人体(煤)矽肺标本中于病变区(结节性病灶和弥漫性间质纤维化区域)缺失表达。4免疫荧光结果显示在人体矽肺标本中有α-Ac-Tub和vimentin、α-Ac-Tub和SP-A阳性共定位表达的细胞,其中vimentin在病变纤维化区域的表达明显增强,而α-Ac-Tub和SP-A在病变的结节病灶和间质纤维化区域缺失表达。第二部分ac-sdkp靶向调节α-ac-tub的表达对抑制大鼠矽肺纤维化的调控作用目的:采用支气管灌注sio2构建矽肺大鼠模型,并予以ac-sdkp抗纤维化治疗和预防治疗。通过对α-ac-tub、hdac6和α-sma在矽肺大鼠肺组织中的定位、分布与表达的观察与分析,研究与探讨α-ac-tub在矽肺发生过程中的作用,以及ac-sdkp对α-ac-tub调节在抑制矽肺纤维化形成时的作用与机制。方法:1采用非暴露式一次性灌注sio2构建矽肺大鼠模型。实验分组为:1)对照4w组:在腹腔内埋入注有2ml生理盐水的微量缓释胶囊,支气管内灌注1ml生理盐水,饲养4w后处理动物;2)对照8w组:腹腔内埋入注有2ml生理盐水的微量缓释胶囊,支气管内灌注1ml生理盐水,饲养8w后处理动物;3)矽肺模型4w组:在腹腔内埋入注有2ml生理盐水的微量缓释胶囊,支气管内灌注含有50mgsio2的1ml生理盐水,饲养4w后处理动物;4)矽肺模型8w组:在腹腔内埋入注有2ml生理盐水的微量缓释胶囊,支气管内灌注含有50mgsio2的1ml生理盐水,饲养8w后处理动物;5)ac-sdkp抗纤维化治疗组:支气管内灌注含有50mgsio2的1ml生理盐水,在腹腔内埋入注有2ml生理盐水的微量缓释胶囊,4w后更换为含有800μg/kg/dac-sdkp的2ml生理盐水的微量缓释胶囊,持续至8w后处理;6)ac-sdkp预防治疗组:灌尘前48h腹腔内埋入含有800μg/kg/dac-sdkp的2ml生理盐水的微量缓释胶囊,支气管内灌注含有50mgsio2的1ml生理盐水,持续至8w后处理。2he染色观察肺组织病理形态;免疫组织化学染色检测α-ac-tub、α-sma、hdac6在肺组织中的定位、分布与表达。免疫荧光法检测α-ac-tub和α-tub、α-ac-tub和sp-a、α-ac-tub和vimentin、hdac6和α-ac-tub、hdac6和α-sma的共表达。免疫印迹法(westernblot)检测α-sma、α-ac-tub、hdac6和i型胶原的表达水平。结果:1he染色结果显示,对照4w组和8w组大鼠双侧肺组织结构清晰,未见明显异常。矽肺模型4w组可见肺泡壁增宽,多伴有巨噬细胞和炎细胞的浸润,可见细胞性矽结节的形成;矽肺模型8w组多见矽结节的融合,伴有间质肺纤维化的形成。无论是ac-sdkp抗纤维化治疗组还是预防治疗组,其矽结节的面积较矽肺模型8w组显著减小,肺组织内纤维化程度明显降低。2免疫组织化学染色结果显示,α-ac-tub除可强表达于支气管上皮细胞外,还可在肺泡壁上的肺泡Ⅱ型上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞中阳性表达,使用不同公司商品化抗体均获得一致的结果。免疫荧光结果显示α-ac-tub存在和sp-a以及vimentin阳性共表达细胞。3免疫组织化学染色结果显示,在对照组中,α-sma仅阳性表达于气管、血管的平滑肌细胞,而在矽肺模型组中,α-sma可强表达于矽结节和间质纤维化区。而α-ac-tub除可阳性表达于支气管纤毛上皮细胞,而在肺泡壁上多种细胞中阳性表达;在矽肺模型组中,α-ac-tub在矽结节和间质纤维化区域中缺失表达,尚在矽结节周围较为正常肺泡壁中仍存在明显的阳性表达。免疫印迹(westernblot)结果显示,与对照组相比,矽肺模型组的i型胶原、α-sma表达水平上调,而α-ac-tub的表达下调;给予ac-sdkp抗纤维化治疗组或预防治疗后,能够显著上调α-ac-tub的表达,同时下调i型胶原和α-sma蛋白水平。4免疫组织化学染色结果显示,hdac6在正常对照组中可阳性表达于支气管上皮细胞(胞浆表达)和部分肺泡Ⅱ型上皮细胞(核表达)中,而在模型组中多表达于巨噬细胞和间质纤维化区域(胞浆表达)。免疫荧光检测结果显示,hdac6与α-sma多高表达于矽结节区域,而α-ac-tub阳性表达多位于矽结节边缘以及较为正常的肺泡壁上。免疫印迹(westernblot)结果显示,与对照组相比,模型组hdac6的表达显著上调,而给予ac-sdkp抗纤维化治疗和预防治疗均能够显著抑制hdac6的表达。第三部分ac-sdkp对α-ac-tub的调节抑制angⅡ介导的肌成纤维细胞分化的作用及其机制目的:原代培养的大鼠肺成纤维细胞,并予以angⅡ诱导分化为肌成纤维细胞。给予ac-sdkp、at1抑制剂valsartan、hdac6特异性抑制剂tcshdac620b和rock信号抑制剂y-27632预处理,观察ac-sdkp是否可通过对at1、rock信号通路的调节而抑制hdac6的表达,进而稳定α-ac-tub,发挥其抑制肌成纤维细胞分化的作用。方法:将原代培养大鼠肺成纤维细胞分组为:1)对照组;2)angⅡ诱导组;3)AngⅡ+Ac-SDKP组;4)AngⅡ+valsartan组;5)AngⅡ+TCS HDAC6 20b组;6)AngⅡ+Y-27632组。结果:1免疫荧光结果显示,AngⅡ诱导后,α-Tub荧光强度并无明显变化,而α-Ac-Tub荧光强度显著降低。2免疫荧光结果显示,与对照组相比,AngⅡ能够显著诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,胞浆内出现大量交叉和平行排列的肌丝样α-SMA蛋白在胞浆内呈现少量绿色的微弱荧光表达,α-Ac-Tub蛋白在胞浆以细胞核为中心呈现出放射状细丝样红色荧光表达;AngⅡ显著促进α-SMA的表达,胞浆内α-SMA呈现为或交叉或平行的肌丝样结构,而标记α-Ac-Tub的荧光明显减弱。予以Ac-SDKP、valsartan、TCS HDAC620b以及Y-27632预处理,较于AngⅡ诱导组比较,能够显著减弱α-SMA的荧光强度,而增加α-Ac-Tub荧光表达。免疫印迹(western blot)结果显示:与对照组相比,AngⅡ组的Ⅰ型胶原和α-SMA表达水平显著上调,而α-Ac-Tub的表达下调;予以Ac-SDKP、valsartan、TCS HDAC620b以及Y-27632预处理能够显著抑制AngⅡ诱导的相应蛋白变化。3免疫印迹法结果显示,与对照组相比,AngⅡ能够显著上调HDAC6的蛋白表达水平,而予以Ac-SDKP、valsartan、TCS HDAC620b以及Y-27632预处理,均能够显著抑制HDAC6蛋白水平表达的上调。结论:1α-Ac-Tub蛋白表达下调参与了矽肺纤维化发生、发展的调控。2 Ac-SDKP能够通过AT1、HDAC6和ROCK信号的调节,稳定α-Ac-Tub蛋白的表达,从而发挥抗矽肺纤维化的作用。