心搏骤停(cardiac arrest,CA)引起的全脑缺血及再灌注损伤是导致心跳骤停复苏后患者存活率较低的重要原因。脑组织因其对缺氧缺血耐受性低，并且对缺血再灌注的特有反应，心肺复苏（Cardiopulmonary resuscitation，CPR）后的脑保护一直是目前研究的难题。CA/CPR引起脑损害包括自由基形成、钙超载、酶联反应和死亡信号传导通路激活等复杂机制，最终结局是神经元细胞的逐渐凋亡坏死。复苏低温治疗已被大量临床研究证明能够提高复苏成功率并显著改善生存和神经功能预后，为多个专业协会推荐。进行低温治疗实施的时机和维持时间温度范围目前还没有统一的标准。但目前普遍认为，心搏骤停后心肺脑复苏时应尽早进行有效的低温治疗。但现有降温方法或多或少存在些不足（效果差、不易控制、复杂、昂贵、有潜在副作用），且低温脑保护的相关分子机制仍不清楚。我们前期根据颈部解剖特点研制出了颈部降温装置，并经前期动物实验研究中证实：其能有效抓住心肺复苏后脑损伤的早期治疗窗口，达到早期迅速降低脑组织温度的目的。为了进一步研究颈部降温对CPR早期保护作用，本研究拟采用心跳骤停兔模型，使用自行研制的颈部降温装置，在复苏同时快速降低颈部温度，在自主循环恢复（Return of spontaneous circulation, ROSC）之前先将进入脑组织的血液预先降温，达到对复苏后脑组织进行低温再灌注和迅速降低脑温的目标。观察此法与常规复苏后低温治疗相比是否更改善复苏成功率、存活率、减轻神经系统功能损伤。并应用PCR、Westen blot、TUNEL、电镜等方法，探讨PI3K/Akt/GSK-3β信号通路在亚低温中如何发挥神经保护作用机制，其作用效应器的靶点位于何处；PI3K/Akt/GSK-3β通路的活化如何调节与细胞凋亡密切相关的线粒体膜稳定性的关系；以及caspase、cytc等凋亡相关基因的表达。进一步阐明亚低温脑保护作用的分子机制，为亚低温的临床治疗应用提供实验和理论依据。第一部分兔心跳骤停与复苏模型的建立目的:建立有效的家兔右心室致颤心肺脑复苏(CPCR)模型。方法:新西兰大白兔10只,采用右心室导管放置心内电极交流电致颤法CA的动物模型.循环停止4min后开始CPR,通过测定ROSC后不同时间位点血清NSE水平与神经功能缺陷评分(Neural deficit Score，NDS)，并记录生命体征、自主循环恢复时间，复苏成功率，48h存活率等。结果:结果本实验中的10只兔子全部诱发CA成功，在有效电刺激开始后，股动脉血压表明造模兔迅速发生循环停止。电刺激结束后10只均表现为室颤(ventricularfibrillation,VF)。尝试复苏时间为326.22±154.78s,复苏成功6只，48h存活率为50%。所有兔术前NDS评分均零分，ROSC后6小时评分最低，12小时起神经功能逐渐恢复。在ROSC后6hNSE水平升高后一直维持较高水平，各时点于基线相比均有显著差异(P<0.01)。结论：这一模型操作虽较复杂，但致颤成功率高，ROSC恢复率及48h存活率较理想，与临床典型的CA/CPR过程类似，结果稳定、可靠，是一个比较理想的心肺脑复苏动物模型。第二部分颈部快速诱导脑部低温对心肺复苏兔的脑保护作用研究目的：比较复苏同时即刻降温与常规复苏和复苏后降温治疗相比是否更改善复苏成功率、存活率、神经系统功能。方法：24只健康雄性新西兰家兔采用4min室颤模型，随机分为3组，每组8只。（1）常温复苏组（normothermia theat NT组）：常规致颤复苏，不行降温干预。（2）复苏中降温组（intra-arrest therapeutic hypothermia IATH组），于心肺复苏同时启动颈部快速降温，目标脑温为34℃，以后维持目标脑温至ROSC后4小时。（3）复苏后1小时降温组（post-arrest therapeutic hypothermia PATH组），于心肺复苏后1小时启动颈部快速降温，目标脑温为34℃，余同组2。观察复苏成功率、4小时内脑温、肛温、血流动力学、呼吸功能的变化，24小时NDS评分。结果：IATH组有7只而NT组和PATH组分别有4只和5只复苏成功；在诱发室颤4分钟后，各组间的肛温、脑温没有显著性差异；经过4分钟的心肺复苏，IATH组、NT组、PATH组动物的脑温度分别为37.4±0.7℃、38.2±0.3℃、38.1±0.5℃，IATH组与另外两组比较有统计学意义(P<0.05)；各组肛温无明显差异。在心肺复苏4分钟内，IATH组的舒张压从5.2mmHg升至42mmHg，而NT组和PATH组仅从5.7mmHg增高至32mmHg，和5.4mmHg增高至31mmHg (P＜0.05)。复苏期间各组收缩压没有明显差异。IATH组的48小时生存率明显高于NT组，两者相比差异有统计学意义(P＜0.05)。复苏后24小时的NDS评分各组均较差，各组间差异不明显，但颈部降温组的评分还是好于常温复苏组。结论：在心肺复苏同时行颈部降温能早期选择降低脑温，提高复苏时舒张压，进而提升复苏时的冠脉灌注压，提高心肺复苏成功率,提高复苏兔的48小时生存率。第三部分PI3K/AKt/GSK3β信号通路在复苏中颈部降温的脑保护作用机制目的：研究PI3K/Akt/GSK3β信号通路在颈部降温的调节作用，初步探讨颈部降温的脑保护作用是否与PI3K/Akt及GSK3β的磷酸化有关。方法：健康雄性新西兰家兔随机分为5组，采用4min室颤模型。按照复苏后4、9、24小时不同时间点再分别分成3个亚组（1）假手术组：常规手术操作置管，不诱导CA，于术后30分钟处死取标本。（2）常温复苏组（normothermia theat NT组）：常规致颤复苏并于4、9、24小时时间点处死动物取标本。（3）复苏中降温组（intra-arresttherapeutic hypothermia IATH组）：于心肺复苏同时启动颈部快速降温，目标脑温为34℃，以后维持目标脑温至ROSC后4小时。于4、9、24小时时间点处死动物取标本（4）复苏中降温+LY294002（LY294002组）：复苏前20分钟脑室注射LY294002，余同组3。（5）复苏后1小时降温组（post-arrest therapeutic hypothermia PATH组），于心肺复苏后1小时启动颈部快速降温，目标脑温为34℃，余同组3。LY294002溶于DMSO稀释成10μ M，在动物脑立体定位仪下在ROSC前20min前给予脑室内注射，其余各组给予溶剂DMSO。动物分别4h、9h、24h过量麻醉处死，采集标本，若复苏失败或在相应时间点之前发生死亡的，该动物的实验数据不录用，另外进行补充动物实验，保证各组5只动物。应用Western blotting检测Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β (ser9)、的蛋白表达，运用TUNEL等方法观察各组组织凋亡变化。结果：与Sham组比较，常温心肺复苏组兔脑细胞胞质中的Akt (Thr-308)磷酸化水平（P-AKT）和P-GSK3β在心肺复苏后4、9、24小时明显减低，并呈逐步减低趋势(p<O．05)；复苏后即刻颈部降温组P-AKT和P-GSK3β水平在心肺复苏后4、9、24小时各时间点均较常温复苏组明显增强(p<O.05)；复苏后1小时降温组的蛋白表达水平各时间点也较常温复苏组有增强(p<O.05)，但弱于复苏后即刻颈部降温组；脑室内注射LY294002去除了亚低温的这一作用，表明了LY294002抑制Akt的磷酸化。复苏即刻降温组和复苏后一小时降温组的凋亡细胞较常规复苏组和LY294002组明显减少(P<0.05)。结论：颈部降温能减轻复苏后兔脑神经细胞的损伤，复苏时即刻降温能有更好的脑保护作用。低温的脑保护作用能够被PI3K/Akt通路的阻断剂所阻断。说明亚低温的脑保护作用是通过PI3K/Akt通路的激活来实现的。颈部降温可通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路，使蛋白激酶B的活化，促进GSK3β的磷酸化,发挥神经保护作用。PI3K/Akt通路阻断剂LY294002可抑制复苏后脑组织Akt的活化，从而抑制了下游GSK3β的磷酸化,抵消降温的神经保护作用。第四部分颈部降温通过PI3K/Akt/GSK3β信号通路抑制线粒体凋亡途径目的：探讨心肺复苏后兔脑线粒体mPTP开放、caspase-9、caspase-3及cytc激活释放的特点；并在此基础上进一步研究颈部降温是否通过PI3K/Akt/GSK3β通路抑制线粒体凋亡途径，从而减轻脑损伤的。方法：健康雄性新西兰家兔随机分为5组，随机分为5组，采用4min室颤模型。（1）假手术组，常规手术操作置管，不诱导CA，于术后30分钟处死取标本。（2）常温复苏组（normothermia theat NT组）:常规致颤复苏并于4、9、24小时时间点处死动物取标本。（3）复苏中降温组（intra-arrest therapeutic hypothermia IATH组）于心肺复苏同时启动颈部快速降温，目标脑温为34℃，以后维持目标脑温至ROSC后4小时,于4、9、24小时时间点处死动物取标本（4）复苏中降温+LY294002（LY294002组）:复苏前20分钟脑室注射LY294002，余同组3。（5）复苏后1小时降温组（post-arresttherapeutic hypothermia PATH组）于心肺复苏后1小时启动颈部快速降温，目标脑温为34℃，余同组3。LY294002溶于DMSO稀释成10μ M，在动物脑立体定位仪下在ROSC前20min前给予脑室内注射，其余各组给予溶剂DMSO。动物分别4h、9h、24h过量麻醉处死，采集标本，若复苏失败或在相应时间点之前发生死亡的，该动物的实验数据不录用，另外进行补充动物实验，保证各组5只动物。用Western blot进一步检测caspase-9、caspase-3及cytc表达，分光光度法测兔脑神经细胞mPTP开放度。结果： sham组神经元中caspase-9、caspase-3及cytc表达的表达量极少。与Sham组相比较，NT组明显增加各时点mPTP开放及caspase-9、caspase-3及cytc蛋白的表达(P<O．05)。与NT组相比较，颈部降温能减少各时点mPTP开放、降低caspase-9、caspase-3及cytc蛋白表达(P<O．05)。同样，PI3K特异性抑制剂LY294002可以抵消颈部降温抑制凋亡的效应。电镜下Sham组的神经细胞胞浆内可见线粒体和内质网，细胞器结构形态完整，髓鞘结构致密。NT组神经细胞核染色质大部凝集，核周围呈空洞状，髓鞘排列不规则，部分线粒肿胀，线粒体体嵴破坏，胞浆内有较多空泡。IATH组和PATH组的超微结构损伤较NT组明显减轻，而LY294002组的超微结构损伤又有所加重结论：心肺复苏后脑组织神经元线粒体mPTP的开放和caspase-9、caspase-3激活，cytc释放；颈部降温可通过激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路抑制线粒体mPTP的开放和caspase-9、caspase-3的激活，抑制线粒体凋亡途径，减少缺血及缺血再灌注造成神经元的死亡，这可能是亚低温减轻心肺复苏后脑损伤的机制之一。