听觉信息进入内耳被转换成神经冲动,依次经过耳蜗核(cochlear nucleus,CN)、上橄榄复合体(superior olive complex,SOC)、外侧丘系核(nuclei of lateral lemniscus,NLL)和下丘(inferior colliculus,IC)的处理,由内侧膝状体(medial geniculate body,MGB)中继后传导至听皮层(auditory cortex,AC)。听觉通路中各个核团之间的投射关系极其复杂,既接受来自低位核团的上行投射,又受来自高位核团的下行投射的影响,有的核团还受其对侧核团支配。以往听觉系统的研究主要采用电生理、解剖以及示踪剂等技术,取得了很多成就。我们知道CN是听觉中枢的第一站,主要接受同侧耳蜗的信息传入;SOC是听觉通路中第一个接受双耳信息汇聚性投射的核团;NLL是低位脑干与IC和MGB连接的主要通路;IC作为一个多功能的整合核团,是听觉通路的重要中继站。但是由于技术的限制,听觉系统的研究还有很多问题没有得到解决,我们对听觉系统复杂的神经网络的了解还只是冰山一角。传统的电生理记录方法不能同时记录整个听觉系统中细胞群的反应,解剖和示踪剂方法只能提供解剖结构和突触联系的来源和走向,无法得知该投射的功能。进一步的听觉研究需要一种能特异性标记神经细胞群体的技术。近年来广泛使用的c-Fos基因的表达被认为是中枢神经系统神经元活动的共同基础,为神经生物学研究提供了一种特异性标记多细胞群体的标记技术。C-Fos原癌基因作为一种即刻早期基因,是细胞接受刺激后最先反应的基因之一。当细胞接受刺激时c-Fos基因快速短暂的表达一种叫Fos的核磷酸蛋白。C-Fos基因的表达能被多种刺激如有丝分裂原、缺氧、缺血、光线刺激、声刺激、机械刺激、疼痛刺激等所激活,而且其表达的部位、量和时程随刺激性质、强度及时间而异。由于c-Fos的表达能很大程度上反映被刺激神经元的活动情况,c-Fos基因常被作为神经元活动的标志,广泛用于示踪特定条件下的神经功能通路。C-Fos的表达最早应用于听觉研究是在1991年,G.Ehret和R.Fischer以雌性小鼠为实验动物,分别用50 kHz和20 kHz两个频率的纯音进行刺激,发现在CN和IC中均有c-Fos的表达,此后c-Fos的免疫标记在听觉系统中的应用越来越广泛。标记方法包括针对mRNA的原位杂交和针对Fos蛋白的免疫组化,而且经证明适用于小鼠、大鼠和毛丝鼠。实验手段多样化,其中很多实验都涉及到动物耳蜗的损毁,但是大部分没有考虑到耳蜗损毁后听觉中枢的重组和增益调控。事实上当耳蜗损毁导致声信号传入受阻时,剩余完整的部分听觉中枢会发生重组。本实验的目的就是要明确单耳耳蜗损毁对听觉各个核团神经元活动的影响,并在此基础上利用兴奋性传入信息激活c-Fos基因的诱导表达而抑制性输入降低其表达的特点,声刺激单耳损毁和正常动物,系统的比较听觉核团接收双耳信息和单耳信息时的差别,分析听觉核团接受传入信息的单双侧关系,为研究听觉通路提供线索。另外我们还分析了麻醉对海马、杏仁核和前额叶皮层神经元活动的影响。实验中我们用Fos蛋白的免疫染色技术标记单耳损毁与正常动物不接受任何声音刺激,以及接受噪音和纯音刺激后听觉核团中活动的神经元。用相同的噪音和纯音刺激麻醉和清醒小鼠,检测了海马、杏仁核以及前额叶皮质c-Fos的表达情况,初步分析了麻醉对边缘系统神经元活动的影响。实验采用noise和tone两种声音进行平行实验,不仅分析了两种声音在听觉通路中的差异,两组实验还能起到相互验证的作用。听觉系统研究部分我们将动物分为两大类,一类是正常小鼠,一类是单侧耳蜗损毁的小鼠,两类动物除了耳蜗损毁动物接受损毁手术外其他处理完全一致。首先用牙膏水泥在动物头顶粘上头钉,耳蜗损毁动物则还要用针尖刺破的方法进行耳蜗损毁,然后把动物放在低噪环境中恢复7-8个小时。恢复后把动物固定在屏蔽室的实验台上适应30 min后给声刺激90 min。Noise频率小于50 KHz、时程50 ms、强度为80 dbSPL、上升下降时间为5 ms,每秒给两次声。Tone是5 kHz、15 kHz和45 kHz三个频率纯音的随机发放,间隔时间为230 ms。每个频率的纯音都是时程100 ms、强度80 dbSPL、上升下降时间为5 ms(对照组则不给声刺激)。边缘系统实验中动物经过固定头钉的手术并恢复后,清醒组直接放入屏蔽室适应和给声刺激,麻醉组则用戊巴麻醉后再放入屏蔽室适应和给声刺激。声刺激后马上用心脏灌流法进行蛋白固定,然后取脑,脑袋经后固定和糖沉后在冰冻切片机中做40 μ厚的连续冠状切片。取目标脑片进行链霉亲和素-过氧化物酶法染色,染色结果拍照保存。实验发现正常小鼠的对照组中耳蜗核(CN)没有c-Fos的表达,外上橄榄核(lateral superior olive,LSO)、外侧丘系核(NLL)中只有少量神经元活动,双侧下丘(IC)中大量神经元被Fos标记,内侧膝状体(MGB)和听皮层(AC)中也有部分神经元活动但数量上远少于下丘。结果表明听觉系统低位脑干基础活动较少,而高位中枢特别是下丘神经元活动水平很高。耳蜗损毁后听觉中枢的重组开始于橄榄复合体(SOC):耳蜗核神经元与正常动物一样没有活动;外上橄榄核在损毁侧神经元活动增强;外侧丘系核在损毁对侧出现神经元活动增强;下丘损毁对侧神经元活动受到抑制;损毁对侧内侧膝状体和听皮层神经元活动水平下降。比较两类动物各听觉核团中声激活神经元的数量时,我们发现耳蜗损毁后只有损毁对侧(保留侧)耳蜗核中有被激活的神经元,提示CN神经元只接受同侧听神经的输入;声刺激后损毁侧外上橄榄核神经元的活动受到抑制,损毁对侧神经元被激活,而且表现出一定的频率相关性。噪音刺激后阳性细胞遍布LSO整个区域,纯音刺激后阳性细胞主要位于LSO的外侧肢。提示LSO神经元接受兴奋性的同侧输入和抑制性的对侧输入信息;NLL中阳性细胞主要位于损毁侧,损毁对侧DNLL神经元活动与给声前一致,ILL中有所降低,对侧外侧丘系腹侧核(ventral nuclei of lateral lemniscus,VNLL)中甚至没有阳性细胞。结合数据和既往对NLL的研究,我们推断NLL主要接受对侧耳的兴奋支配,和少量同侧耳的抑制性支配;在IC中,活动的神经元主要出现在损毁侧,对侧只有非常少数的神经元活动,而且损毁侧IC中声激活的神经元比正常小鼠IC中少。证明IC主要接受对侧CN的兴奋信息,与对侧IC也有联系;MGB中我们发现声刺激没有诱发其腹侧区(ventral part of MGB,MGV)和背侧区(dorsal part of MGB,MGD)神经元的活动,只发现内侧区(medial part of MGB,MGM)和内膝体上丘脑核团(suprageniculate thalamic nucleus,SG)中有c-Fos的表达;听皮层神经细胞被声刺激特异性激活,而且耳蜗损毁后损毁对侧听皮层中浅层神经细胞的活动受到抑制。说明声音信息进入IC后主要上传至同侧的MGB和AC。对边缘系统的研究我们发现海马和前额叶皮层受麻醉的影响较大,声音刺激清醒状态下海马中大量神经元被激活,而动物麻醉时几乎没有发现被激活的神经元。清醒动物的前额叶皮层中只在靠近前边缘皮层(prelimbic cortex,PrL)的部位有神经元的活动,动物麻醉后不管听什么声音额叶皮质中都没有发现活动的神经元。杏仁核则表现为不同状态下激活的神经群不同,杏仁核通常分为三个主要核群:杏仁中央核、基底外侧核群和皮质内侧核群。清醒状态时活动的神经元位于杏仁中央核和基底外侧核群,麻醉时活动的神经元主要位于皮质内侧核群。麻醉状态时中枢神经系统受到广泛抑制,海马和前额叶皮层神经元几乎没有活动,提示人在深度麻醉时对声信息的整合能力受到影响。综上所述,我们实验发现听觉系统低位脑干核团基础活动较少,安静状态下高位中枢特别是下丘神经元活动水平较高。耳蜗损毁后听觉中枢核团的增益调控与其接受的传入支配有关。比较两类动物各听觉核团中声激活神经元的数量,我们通过免疫组化的方法证实了一些电生理研究中的观点:1.耳蜗核只接受同侧听神经的兴奋性输入。2.外上橄榄核接受同侧耳蜗核的兴奋性和对侧由斜方体内侧核(medial nucleus of trapezoid body,MNTB)中继的抑制性输入。3.下丘接受对侧耳蜗核的兴奋性投射。与此同时,本实验发现NLL中,多核团向DNLL的同侧投射是抑制性的;虽然MGV是听觉特异的感觉接替核,具有明确音频分布,但是单纯的听觉刺激不能激活MGV和MGD神经元的活动;麻醉状态对机体对声信息的整合能力有很大影响。