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第一部分耳聋常见基因GJB2、PDS及线粒体1555A＞G的检测第一章直接测序法检测GJB2基因突变的研究目的：应用PCR+直接测序法研究GJB2基因的分布频率、突变热点、表现型和基因型的关系，为建立新的基因检测方法提供依据及模型。方法：收集50例感音神经性、语前聋患者的临床资料，进行听力检查(电测听或脑干听觉诱发电位)，PER+直接测序法检测GJB2基因。50例听力正常者作对照，x~2检验统计患者组及听力正常组之间基因型频率的差异。结果：50例耳聋患者中，共检出GJB2基因突变突变18例，多态性2例。235delC的突变率最高，占所有突变的63.3％。50例患者组235delC基因型频率24％，正常对照组中发现1例235delC杂合突变携带者，基因型频率2％，P＜0.05，二组差异有统计学意义。12例235delC的患者，极重度耳聋占75％。结论：GJB2基因的突变热点存在种族特异性，235delC的突变率在中国人群中发生率最高，表现型以极重度耳聋多见。第二章变性高效液相色谱技术检测PDS基因突变的研究目的：研究PDS基因的分布频率、突变热点、表现型和基因型的关系，为建立新的基因检测方法提供依据及模型。方法：收集42例确诊前庭水管扩大的患者的临床资料，进行听力检查(电测听或脑干听觉诱发电位)，DHPLC检测PDS基因，统计分析基因型和表现型的关系。结果：42例前庭水管扩大患者共检出PDS基因突变37例(88.1％)，PDS基因突变中最常见的突变为H723R，占所有突变的24.2％，其次为IVS7-2A＞G，占所有突变的21.4％，剪接位发现两种新突变1341+2T＞C，1545-1G＞A。蛋白质截短相关突变组患者(T)的听力损害较非蛋白质截短相关突变组(NT)严重，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：PDS基因突变中，H723R的发生率最高，其次为IVS7-2A＞G突变，前庭水管扩大患者的耳聋程度与基因型有关，移码突变及剪接位突变患者的听力预后较错义突变差。第三章等位基因特异性扩增技术检测线粒体基因1555A＞G的研究目的：检测家系及散发病例的线粒体基因1555A＞G，研究线粒体基因1555A＞G的频率，评价等位基因特异性扩增技术。方法：共采集母系遗传家系3个，共40名家庭成员。散发病例12例。等位基因特异性扩增技术检测线粒体基因1555A＞G．。结果：家系2、3共检出mt DNA1555A＞G突变15例，家系1未检出mt DNA1555A＞G突变，家系的突变频率为15／28(53.6％)，12例散发病例中，检出mt DNA1555A＞G突变1例，突变频率为1／12(8.3％)，11例未检出mt DNA1555A＞G突变。家系2外显率8／8(100％)，家系1外显率3／7(42.8％)。优化反应条件后，等位基因特异性扩增技术检测结果与测序方法一致。结论：呈母系遗传的耳聋家系中，1555 A＞G点突变是重要的致聋原因之一，在散发的个体中氨基糖甙类药物致聋作用的发生存在异质性。等位基因特异性扩增技术可作为一种简便，准确的筛选方法对mt DNA1555A＞G突变进行初筛。第二部分基于多重探针酶链法的基因突变检测新方法的建立目的：建立一种基于多重探针酶链法的基因突变检测新方法。方法：建立单探针及多探针体系，检测50例未知样本，与测序法比较，评价多重探针酶链法的敏感性和特异性。分别取不同的模板DNA量，探针／引物浓度比，杂交时间进行实验，探索最优化的实验条件。结果：建立可检测GJB2，PDS和mt1555A＞G共3个基因，7个突变位点(GJB2基因235delC，PDS基因H723R，IVS7-2A＞G，L236P，IVS8+1G＞A，T416P及mtDNA1555A＞G)的多探针体系。50例样本检测出8例突变患者，其中235delC 5例，H723R1例，IVS7-2 A＞G 1例，mtDNA1555A＞G 1例，其中，2例235delC用多重酶链探针法未检出，敏感性75％(6／8)。测序方法检测42例无突变的样本，多重酶链探针法与测序方法一致，特异性100％(42／42)。优化后的反应条件：DNA200ng，杂交时间大于12小时，探针／引物浓度比大于1：500。结论：多重探针酶链法的建立及成功运用是对聋病基因检测手段的创新和突破，可设计更多的新探针来满足不断更新的检测要求。