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生物钟是生物体内的计时机制,在生理、生化和行为等水平调节生物体的生命活动。生物钟的异常可以导致失眠、精神障碍甚至癌症等许多疾病。生物钟调节的分子机制主要是CLOCK:BMAL1异二聚体做为正向调节因子绑定到负向调节因子(per,cry)的启动子区域的E-box,启动负向调节因子的转录。负向调节因子在细胞浆内翻译后,形成PER:CRY异二聚体,入核与CLOCK:BMAL1相互作用,解除了CLOCK:BMAL1的转录激活作用,完成一个周期的运行。在鸡和小鼠的研究中发现,E4bp4作为亮氨酸拉链转录因子,能够识别绑定生物钟基因的D-box元件抑制其表达,由此参与生物钟调节。在斑马鱼中,由于基因组的大复制,存在六个e4bp4的同源基因。斑马鱼e4bp4如何参与生物钟调节目前尚不清楚。本研究深入研究了其中的e4bp4-2b(e4bp4-5)。荧光定量PCR的方法表明,在LD(light/dark)和DD(dark/dark)的情况下,e4bp4-2b呈现转录振荡。并且原位杂交分析显示,e4bp4-2b主要表达斑马鱼的脑部。启动子分析发现在斑马鱼e4bp4-2b的启动子区域拥有几个E-like boxes。双报告荧光素酶实验展示e4bp4-2b启动子活性可以被Bmal1b和Clock1a复合体所激活,但被Cry1aa所抑制。Ch IP实验显示,Bmal1b可以结合e4bp4-2b启动子上的E-like boxes。这些研究结果揭示了生物钟直接调控斑马鱼中e4bp4-2b。基于在光暗条件下e4bp4-2b的表达有明显的差异,我们提出了其受光控的假设。光照实验揭示了e4bp4-2b表达确实受光上调。e4bp4-2b启动子区域的含有可能接受光应答的重要元件D-box。荧光素酶检测展示了Tefa可以促进e4bp4-2b的表达。然而光是如何通过这个元件传递对该基因的调控尚需深入研究。为了探究e4bp4-2b在斑马鱼生物钟中的作用,我们利用TALEN的技术构建了两种e4bp4-2b突变体系。qRT-PCR实验展示了e4bp4-2b的突变导致几个斑马鱼生物钟核心基因cry1aa、per2、cloack1a以及bmal1b上调。行为实验展示了,在LD条件下,e4bp4-2b突变体的活动量与野生型相比显著下调。我们深入研究了E4bp4-2b对cry1aa调节机制。细胞转染实验展示了e4bp4-2b可以通过cry1aa启动子区域的D-box来抑制cry1aa的表达。Ch IP实验表明E4bp4-2b能够结合cry1aa的D-box。采用e4bp4-2b突变体的全长cDNA做细胞转染实验,发现它丧失了其抑制功能。这些研究结果表明E4bp4-2b为斑马鱼生物钟调节所必须,特别是通过D-box负向调控cry1aa。对于突变体样本选取ZT2和ZT14两个时间点做深度测序。测序结果显示出200余个基因与野生型样品相比存在显著性差异表达。并且这些基因中存在两个时间点同时上调或者下调的基因68个。我们查阅这些基因相关的功能并选取其中四个(eva1a、col28a、capn2和muc5ac)可能与e4bp4-2在癌症生成以及发育方面有关的基因做实时定量PCR实验验证了深度测序的结果。为揭示e4bp4-2b在斑马鱼中关于癌症的发生和发育的功能和寻找其他下游靶基因做出了贡献。总之,我们的研究展示了e4bp4-2b在斑马鱼中是受生物钟调控的,并且对于调控生物钟方面也是必不可少的。而且它的表达同时受到光的调控。E4bp4-2b可以通过绑定在cry1aa基因启动子区域的D-box上负向调控其转录水平。并且,除了它在生物钟方面的作用外,它还和肿瘤的发生发育和自噬有一定的关系。深度测序的结果也有助于挖掘它这方面的功能。所有这些研究的结果都有助于探究其在生物钟和别的生命过程中的作用。