背景:中药炭药的临床应用历史悠久,仲景《金匮要略》中有数个处方与中药制炭相关。如王不留行散后注“桑根皮以上三味烧灰存性,勿令灰过”,枳实芍药散中注“枳实(烧令黑,勿太过)”,其所提出的“烧灰存性,勿令灰过”是最早的炭药炮制标准。目前制炭多以经验判断,临床疗效良莠不齐,炭药用于止血在历代中医用药中占有十分重要的地位,而探究“炒炭止血”关键物质基础成为炭药现代研究的重点和难点。黄柏炭(PCC)是黄柏高温炭化的产物,苦寒之性大减,清热燥湿之中兼有收涩之性,临床常用于治疗便血、崩漏下血等。黄柏含有生物碱类、柠檬苦素类等活性成分,在高温炭化后,原有的这些主要成分几乎完全消失,但却产生了止血作用。虽然PCC的止血效果得到了相当多的临床证据的支持,但其止血作用的物质基础及机制尚不明了。目的:本研究引进纳米学科表征技术,以黄柏炭为研究对象,探究新发现的存在于PCC水煎液中的黄柏炭碳点(PCC-CDs)的制备工艺标准,基于多种出血模型评价PCC-CDs的止血作用并探究其作用机制,证实PCC-CDs是黄柏高温炭化后产生止血作用的关键物质基础之一,为阐明“炒炭止血”物质基础与仲景炭药“烧灰存性”科学内涵提供部分实验依据。方法:1.建立PCC-CDs的制备方法及分离纯化方法,以白眉蛇毒血凝酶(HC)为止血阳性对照药,利用小鼠断尾出血模型初步评价PCC-CDs的止血作用。2.考察马弗炉锻烧温度及时间,运用透射电子显微镜表征技术(TEM),以电镜结果和止血效果为评价指标,优化PCC-CDs的制备条件。3.利用高效液相色谱法(HPLC)对PCC-CDs水溶液进行成分分析;运用TEM、HRTEM、EDS和XPS等技术,结合傅立叶变换红外光谱(FTIR)、紫外光谱(UV-Vis)、荧光光谱(FL)等现代中药研究常用分析技术,对优选出的PCC-CDs进行理化性质表征并计算其量子产率。4.通过细胞计数试剂盒(CCK-8)检测不同浓度PCC-CDs水溶液对细胞活力的影响,评价其细胞毒性,初步获取PCC-CDs的安全性参数。5.运用断尾出血模型考察皮下注射(sc),灌胃注射(ig)和腹腔注射(ip)3种给药方式PCC-CDs的止血效果。运用毛细玻璃管法,测定PCC-CDs单次给药后10min、45min、90min、120min、180min、300min和480min各时间点的凝血时间。采用小鼠断尾出血、肝脏损伤出血模型,考察PCC-CDs止血作用的量-效关系。通过PCC-CDs肝素钠拮抗实验及其对小鼠血小板计数(PLT)和凝血四项(PT、APTT、TT、FIB)的影响,探究PCC-CDs发挥止血作用可能的途径。6.建立五步蛇毒(AAV)急性出血模型,设对照组、模型组、PCC-CDs高、中、低剂量组,每组按时间点(1h、3 h、12 h、1d、2d和5d)设6个亚组。各组各时间点取全血检测PLT,取血浆检测6-keto-PGF1α、TXB2、t-PA和PAI-1的含量,探究PCC-CDs对AAV急性出血模型的止血作用及其作用机制。各组各时间点取血清检测BUN、CRE,取肾脏行HE染色观察肾脏病理光镜改变,以ELISA法检测肾组织中IL-10、IL-1β和MCP-1的含量,探究PCC-CDs对AAV出血致小鼠急性肾损伤的保护作用及机制。结果:1.在马弗炉300℃煅烧1h的制备条件下,所得PCC-CDs电镜下呈较均匀分散的球形,粒径小于10 nm,晶格间距约为0.24 nm。在断尾出血模型中,PCC组和PCC-CDs组的止血时间无差别(P>0.05),二者与NS组、黄柏生药组相比,止血时间均明显缩短(P<0.05),与HC组止血时间差异无统计学意义(P>0.05)。2.在PCC-CDs制备方法的考察中,马弗炉煅烧温度分别为250℃、300℃、350℃、400℃和450℃时,所得PCC的制炭产率及电镜下粒径和形状均存在差异,止血效果也不尽相同,综合电镜结果和止血效果,优选出350℃组。进一步考察350℃条件下的煅烧时间,分别为15 min、30 min、45 min和60min,综合电镜结果和止血效果优选出60min组。最终PCC-CDs的最优化制备条件为马弗炉350℃煅烧1 h。3.PCC-CDs成分分析及理化性质表征:(1)HPLC法检测PCC-CDs水溶液,未检测到存在于生黄柏中的生物碱类和柠檬苦素类等活性成分。(2)PCC-CDs的形貌:PCC-CDs在TEM下呈球形并均匀分布,直径范围为1.2-4.8nm,粒径分布为2.640±0.694 nm;经HRTEM衍射测得PCC-CDs的晶格间距约为0.232 nm。(3)PCC-CDs光谱性质:①UV-Vis显示PCC-CDs在270 nm处有一个弱吸收峰。②FL结果显示PCC-CDs的最强发射波长为438 nm,最强激发波长为363 nm。③FTIR结果显示PCC-CDs在3385、3130、2925、2860、1566、1401 和 1121 cm-1 处显示特征吸收峰。3385cm-1处为-N-H基团;在3130cm-1处可观察到-O-H基团的存在;在2925和2860cm-1处的微弱吸收归属于-CH的伸缩;此外,PCC-CDs中1566 cm-1处的吸收峰被认为是-C=O的特征吸收峰;PCC-CDs在1401cm-1处的吸收峰可能为C-N,N-H或COO-基团;在1121cm-1处的吸收峰为-C-O。(4)PCC-CDs的元素及表面结构:EDS结果表明PCC-CDs主要由C和O组成,含量比为575:175,接近于3,与XPS的结果相一致。XPS结果表明PCC-CDs主要由碳(71.64%,原子百分比),氮(1.30%,原子百分比)和氧(23.26%,原子百分比)组成。经XPS分峰分析得PCC-CDs表面可能存在C-C/C=C、C=O、C-O、C=N、O-C=O、C-OH、C=O、N=C、C-N-C和N-(C)3等官能团。XPS的分析结果与FTIR结果相一致。(5)PCC-CDs提取率为0.26%,相对量子产率为9.62%。4.在CCK-8细胞毒性实验中,当PCC-CDs水溶液浓度为0、0.01、0.1、1、10、100和1000μg/mL时,细胞活力均在100%左右,而浓度为5000μg/mL时细胞活力开始下降,浓度为10000 μg/mL时细胞活力逐渐下降至52.78%。5.PCC-CDs的止血作用及其作用机制研究:(1)与NS组相比,sc、ig和ip3种给药方式断尾止血时间均缩短,差异具有统计学意义(P<0.05);sc和ip组止血时间与阳性对照组无差别(P>0.05)。(2)PCC-CDs单次给药后,10 min已表现出促凝作用,10 min、45 min、90 min、120 min、180 min和300 min各时间点给药组凝血时间与对照组差异均具有统计学意义(P<0.05),自300min至480min,给药组凝血时间逐渐延长至与对照组趋同(P>0.05)。(3)在小鼠断尾出血和肝脏损伤出血两种实验模型中,PCC-CDs组止血时间明显缩短,与NS组相比差异具有统计学意义(P<0.05)且与阳性药无差别(P>0.05)。(4)PCC-CDs肝素钠拮抗实验中,与NS组相比,HC组、PCC-CDs组和HS+PCC-CDs组止血时间均缩短(P<0.05);PCC-CDs组与HC组止血时间无差别(P>0.05);与PCC-CDs组相比,HS+PCC-CDs组止血时间明显延长(P<0.05)。(5)PLT与凝血四项测定结果:与NS相比,PCC-CDs组PLT、FIB升高(P<0.05),PT降低(P<0.05)。6.PCC-CDs对AAV急性出血模型的作用及其机制研究:(1)在AAV造模剂量考察实验中,LD50组(2mg/kg)死亡4只小鼠,其余组小鼠无死亡;1/2倍LD50组和1/4倍LD50组小鼠均出现了中毒症状。LD50组PLT下降至(134.00±42.81)× 109/L,1/2 倍 LD50 组 PLT 下降至(343.80±63.41)× 109/L,1/4 倍 LD50 组下降至(751.30±70.64)× 1 09/L,与 NS 组[(1160.10±77.38)× 1 09/L]相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。综合分析筛选出的建立AAV急性出血模型的AAV剂量为1 mg/kg。(2)AAV急性出血实验中,模型组在1h、3h、12h、1d和2d,5个时间点的PLT均比NS组下降(P<0.05),而治疗组抑制了AAV所导致的PLT下降,其中高剂量组3 h、12 h、1d和2d4个时间点与模型组差异均具有统计学意义(P<0.05)。与NS组相比,模型组的6-keto-PGF1α和t-PA升高(P<0.05)、TXB2和PAI-1下降(P<0.05),而治疗组可明显抑制AAV造成的TXB2和PAI-1的下降,且可缓解6-keto-PGF1α和t-PA的升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)在探究PCC-CDs对AAV出血致小鼠急性肾损伤保护作用及其机制的实验中,1 d、2d和5d,3个时间点模型组BUN、CRE比NS组升高(P<0.05),而治疗组可抑制AAV造成的BUN、CRE的升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组肾脏病理形态学结果:1h即可见肾小球充血,肾小管周围毛细血管充血,肾小管肿胀扩张,小管上皮细胞水肿、变性,而治疗组肾小管肿胀和充血均较模型组减轻。模型组IL-10、IL-1β和MCP-1,与NS组相比升高(P<0.05),而治疗组可抑制AAV造成的IL-10、IL-1β和MCP-1的升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.本研究首次发现黄柏炭碳点,优选出的制备条件为马弗炉350℃锻烧1h。所得黄柏炭碳点为直径1.2-4.8nm、晶格间距0.232nm、制炭产率39.28%,主要由C、O、N元素组成,表面存在羰基、羧基、羟基、醚基和氨基等活性官能团的类碳点成分。黄柏炭碳点水溶液中不存在小分子、金属离子或盐类等常规的中药药效活性成分。2.黄柏炭碳点水溶液浓度低于1000μg/mL(约相当于PCC3g/mL)时无细胞毒性,体内外均具有与白眉蛇毒血凝酶相当的止血作用,单次给药其止血效应自10 min起至5h维持在较高水平,5-8 h逐渐降至正常,推荐给药方式为皮下注射和腹腔注射。3.黄柏炭碳点主要通过激活内源性凝血途径,增加血小板含量、提高TXB2含量促进血小板聚集,促进纤维蛋白的生成,提高PAI-1含量抑制纤溶系统活性发挥止血作用。4.以黄柏炭为例,“炒炭止血”物质基础与仲景炭药“烧灰存性”科学内涵可阐释为“表面存在大量可塑性活性基团的黄柏炭碳点是黄柏炭发挥止血作用的关键物质基础之一。在制备黄柏炭时,马弗炉350℃锻烧1h以制备止血作用最佳的黄柏炭碳点,太过或不及不能产生止血作用或止血作用较弱”。