研究背景和目的结直肠癌占我国恶性肿瘤发病率的第四位,80%患者因出现转移而死亡。肿瘤转移可导致多器官的广泛性结构与功能的破坏,最终致患者死亡。肿瘤细胞以及所在的微环境,共同参与了肿瘤的侵袭与转移。阻断肿瘤细胞与微环境的相互作用,阻止肿瘤细胞定向迁移,是抗肿瘤转移治疗研究必须解决的难题。VEGF是由肿瘤细胞与间质细胞分泌的活性因子,主要促进内皮细胞的迁移和血管发生,参与肿瘤血管生成、促进瘤细胞增生和肿瘤转移,靶向抑制VEGF已成为肿瘤治疗的重要手段之一。Cdc42是一种鸟嘌呤三核苷酸(GTP)酶,在细胞膜及细胞浆中表达,在细胞中有两种存在形式,即活性形式和非活性形式。细胞接受到外界或者细胞内部本身的信号刺激时,活化的Cdc42与非活化形式相互转换,开启或关闭其下游信号通路。已有研究表明,VEGF/NRP1结合可以激活Cdc42,使Cdc42处于活化状态,促进丝状伪足的形成。前期,我们课题组通过免疫组化检测结直肠癌组织中Prohibitin(PHB)的表达,癌细胞表达PHB出现向心性分布与离心性分布两种方式。向心性分布的PHB表达于癌细胞的腺腔缘,维持肿瘤细胞的尖-底极性,离心性分布的PHB表达于癌细胞面向间质端,展现癌细胞的前-后极性,VEGF可以诱导PHB在癌细胞前导缘聚集,使PHB在癌细胞呈现出前-后极性分布方式。同时发现PHB和Cdc42存在直接相互作用,VEGF诱导Cdc42在结直肠癌细胞中发生重定位,细胞外VEGF的刺激可以促进结直肠癌细胞发生定向迁移。本课题拟在解决:1.Cdc42在结直肠癌细胞中重新定位的分子机制是什么?2.VEGF如何诱导结直肠癌细胞的定向迁移?研究方法1.采用酶联免疫吸附试验(ELISA),检测结直肠癌细胞(LS174T、SW480、SW620)和间质细胞(成纤维细胞、HUVEC、PBMC)混合培养后,培养上清中VEGF表达水平改变;通过免疫组化分析结直肠癌组织标本中VEGF表达水平与结直肠癌转移的相关性。2.Pull-down(GST-PAK1)实验检测细胞株在不同处理情况下活化型Cdc42,即GTP-Cdc42表达量的改变。3.膜浆分离实验检测不同处理情况下细胞膜中Cdc42蛋白含量的变化。4.免疫荧光实验观察结直肠癌细胞在不同处理情况下Cdc42在细胞膜上荧光强度的改变。5.损伤-免疫荧光实验检测Cdc42在细胞中重新定位的改变。6.CO-Immunoprecipitation(CO-IP)验证 NRP-1(VEGF 的受体)和 Cdc42蛋白之间的相互作用关系。7.损伤实验和Transwell实验检测细胞的生物学特性。研究结果1.VEGF刺激下,CRC细胞内的活化型Cdc42表达增加,且Cdc42在细胞膜上的表达增加。与非刺激组相比,我们发现膜上表达增加的Cdc42在损伤方向的比例明显增多,即Cdc42在细胞内发生了重新定位,且具有统计学意义。2.为进一步研究VEGF是如何诱导Cdc42发生重新定位,我们检测VEGF相关受体(VEGFR1/VEGFR2/NRP-1/NRP-2)表达,结果发现癌细胞仅有NRP-1高表达。干扰VEGF受体NRP-1后,在VEGF刺激下,活化型Cdc42的含量降低,胞膜上Cdc42含量也下降,且胞膜上Cdc42在损伤方向上所占的比例低于干扰前所占的比例,且具有统计学意义。3.免疫荧光结果显示,活化型Cdc42增多时,细胞周边丝束状的F-actin骨架数量明显增多,长度增加,且丝状伪足的数量增多;通过对细胞骨架通路蛋白表达量的检测发现活化型Cdc42增多的时候,磷酸化的Cofilin增多,P-Cofilin抑制细胞骨架解聚,使肌动蛋白骨架更加稳定。4.鉴于上述结果发现活化型Cdc42增加,细胞骨架蛋白增加,我们对细胞的部分生物学特性做了检测,实验结果发现,骨架蛋白增多时,丝状伪足的形成增多,细胞迁移的距离较远,细胞的侵袭能力较强。研究结论1.VEGF刺激下结直肠癌细胞内Cdc42激活并重新定位。2.细胞膜受体NRP-1介导VEGF刺激下的Cdc42激活和重新定位。3.激活的Cdc42促进结直肠癌细胞骨架重组。4.VEGF刺激后重组的细胞骨架,促进结直肠癌细胞定向迁移。