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糖基水解酶18家族(GH18)几丁质酶(chitinase, EC3.2.1.14)随机催化水解几丁质(chitin)和壳糊精(chitodextrins)的β-1,4糖苷键。该酶广泛分布于细菌、真菌、昆虫、植物和哺乳动物等生物体内,在营养、病原菌入侵、节肢动物蜕皮、免疫和防御等生理过程中发挥着重要作用。解析并获得GH18几丁质酶的结构和功能的关系对于疾病控制、植物保护和药物设计均具有重要意义。与其他物种相比,昆虫是GH18几丁质酶含量最丰富的生物体,包含8个分支。其中group Ⅰ几丁质酶负责昆虫蜕皮时旧表皮的几丁质降解,对于昆虫的生长发育至关重要。目前尚无昆虫几丁质酶结构与功能的报导。本论文以农业害虫亚洲玉米螟的group Ⅰ几丁质酶OfChtI为研究对象,主要获得以下结论：1) OfChtl具有独特的结构特征重组表达的全长OfChtl不稳定,我们因此重组表达并结晶催化域(OfChtI-CAD)并解析得到分辨率为1.7A的OfChtI-CAD晶体结构(PDB登录号3w4r)。晶体结构分析表明OfChtI-CAD包含核心域和几丁质插入域。核心域为典型的(β/α)8折叠桶结构,催化残基指纹序列144DxDxE148位于β4和α4之间的loop上,而几丁质插入域形成活性裂缝的一面墙。OfChtI-CAD拥有长且两端开放的底物结合裂缝,依次排列9个可能结合底物糖基的芳香族氨基酸残基。其不同于所有已知结构的几丁质酶的特征是：在底物结合裂缝的末端,有四个芳香族氨基酸(Phe159、Phe194、Trp240和Tyr290)形成一个疏水平面。单点突变体F159A、F194A、W241A、Y290A、双突变体F194A/W241A、F159A/Y290A和四点突变体F159A/F194A/W241AA/Y290A结合几丁质的能力均较野生型(OfChtI-CAD低。其中四点突变结合能力最低,仅为野生型的40%。说明这个独特的疏水平面的生理功能与OfChtI-CAD的几丁质结合能力正相关。2) OfChtI具有随机水解几丁寡糖的内切活性为了研究OfChtI-CAD水解底物的特性,我们首先利用热力学方法分析了几丁寡糖在OfChtI-CAD活性裂缝中的结合情况。实验结果表明几丁寡糖(GlcNAc)3-6与OfChtI-CAD结合的焓变、熵变均小于零,且|-T△S|>|△H|,表明结合均为熵驱动(焓变也产生一部分贡献),说明结合主要伴随着蛋白与底物的构像变化和水分子的排出。从(GlcNAc)3到(GlcNAc)6,每增加一个糖单元,自由能降低1.0kcal mol-1,表明OfChtI催化域包含至少6个糖基结合位点。为了分析OfChtI-CAD的催化特性,我们利用浸泡法,将OfChtI-CAD的晶体与几丁寡糖(GlcNAc)6共孵育获得分辨率为1.77A的复合物晶体结构(PDB登录号3w11)。OfChtI-CAD的结构在结合配基前后具有很好的重叠性,说明几丁寡糖的进入没有改变酶的活性裂缝以及整体结构。复合物结构中存在两个糖分子：其一为(GlcNAc)3,占据活性裂缝的-1、-2和-3位点；另一个为(GlcNAc)2,位于+1和+2位点。结合在-1位点的GlcNAc呈现能量不利的船式构像,很可能是催化反应刚刚完成时的状态：即产物已经离去,催化相关的Asp146仍然与-1GlcNAc作用。因我们之前的研究表明OfChtI是从底物非还原端开始水解底物,所以(GlcNAc)3应该是(GlcNAc)6的水解产物,因此可以推断OfChtI具有内切性质。3)寡聚葡萄糖胺是OfChtI的抑制剂GH18家族几丁质酶催化水解底物时采用底物辅助保留机制,-1位GlcNAc的乙酰基作为亲核基团进攻C1异头碳。这个过程将导致-1GlcNAc的严重扭曲,从而处于能量不利的不稳定构型。如果-1糖是脱乙酰基的,那么结合GlcN可能是能量上有利的。基于这个假说,我们首次研究并获得了寡聚葡萄糖胺(GlcN)2-7抑制剂,其IC50值在μM-mM水平。同时我们也测试了这些聚糖的体内活性。给亚洲玉米螟5龄幼虫注射(GlcN)2-7混合物,85%的幼虫不能完成幼虫到蛹的生理过程,并在10天后死亡。因OfChtI是负责昆虫蜕皮过程中表皮几丁质的降解,所以该实验结果说明(GlcN)2-7可能在昆虫体内抑制了OfChtI的活性。4)寡聚葡萄糖胺对OfChtI的抑制机理为了研究寡聚葡萄糖胺抑制剂对OfChtI的抑制机理,我们利用热力学方法分析了寡聚葡萄糖胺(GlcN)2-7与OfChtI的结合过程。结果表明这些抑制剂与OfChtI结合的焓变均小于零,且|△H|>|-T△S|,表明反应均为焓驱动,抑制剂与OfChtI的结合伴随着氢键和/或静电作用的形成。(GlcN)5、(GlcN)6和(GlcN)7与OfChtI结合的Kd值相似,说明(GlcN)6,7比(GlcN)5多出的糖基没有对亲和力产生贡献。为了研究这些聚糖抑制作用的分子机制,我们通过浸泡法分别获得了OfChtI-CAD与(GlcN)5(PDB登录号3wqv)和(GlcN)6(PDB登录号3wqw)的复合物晶体结构,分辨率均为2.0A。晶体结构表明(GlcN)6的五个糖与(GlcN)5中的五个糖基结合在相同的亚位点上,即-1、-7、-3、-4和-5亚位点。抑制剂复合物OfChtI-CAD-(GlcN)5与底物复合物OfChtI-CAD-(GlcNAc)2/3的结构比较显示抑制剂和底物在-1和-2位点的结合存在明显差异。为了研究这两个位点对抑制剂结合的作用,我们构建了突变体E148Q和F309A。热力学分析表明,与野生型相比,突变体E148Q对(GlcN)5的结合力下降19倍。酶活性分析表明,突变体E148Q失去了催化活性,而(GlcN)2-7对F309A的抑制活性降低4倍。因此,寡聚葡萄糖胺对OfChtI的抑制作用主要通过与-1和-2位点氨基酸残基相互作用来实现。综上,本论文不仅丰富几丁质酶的多重生理功能与其结构的对应关系,而且对于昆虫介导的疾病控制以及农业害虫防治具有意义。