长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是指核苷酸长度大于200个碱基的不具有蛋白质编码功能的RNA分子。起初认为lncRNA不具备生物学功能，但是越来越多的研究证实lncRNA经折叠后可以形成特定的空间结构，在表观遗传层面、转录和转录后修饰层面以及翻译过程中调控特定基因的表达，在许多生理和病理过程中发挥重要调节作用。已有不少研究证实了肝癌、胃癌、前列腺癌中lncRNA存在异常表达或序列突变，参与肿瘤的增殖、侵袭、转移;并且还可作为肿瘤诊断、分期、预后的独立预测指标。lncRNA在免疫细胞分化、固有免疫和适应性免疫应答中同样发挥重要调控作用。lnc-DC只在人类树突状细胞(Dendriticcells，DC)中特异性表达，通过与转录因子STAT3(Signal transducer and activator oftranscription3)结合，促进单核细胞向DC分化，同时增强DC活化T细胞的能力。X染色体上存在许多与机体免疫功能相关的基因如肿瘤坏死因子a(Tumor necrosisfactor-a，TNF-a)、CD40配体（Cell differentiation ligand，CD40L）、叉头状转录因子P3（Forkhead box P3，FOXP3），而长链非编码RNA Xist(X inactive specifictranscript，Xist)参与X染色体失活过程，Xist的序列结构或功能的改变可能导致X染色体上免疫相关基因的表达异常，这或许可以部分解释许多自身免疫性疾病中女性易感的现象。　　原发性胆汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）是一种以肝内中、小胆管损伤导致胆汁淤积，同时患者血清出现疾病特异的抗线粒体抗体(Anti-mitochondrial antibody，AMA)，并伴有碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、谷氨酰转肽酶（Gamma glutamyl transferase，GGT）等生化指标升高为主要特征的器官特异性自身免疫性疾病，好发于中老年女性，近年来随着自身抗体检测的普及和应用，发病率在逐年上升。感染、环境因素、遗传因素以及表观遗传学因素等均有可能参与PBC的发病，但具体发病机制仍不明确。　　对于lncRNA在PBC中的研究目前还相对较少，无论是肝组织还是外周血中。本课题对PBC患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中lncRNA表达谱的研究可以为PBC的发病机理提供新的思路，也可以为PBC的临床诊断、治疗提供新的途径。　　第一部分:PBC患者lncRNA表达谱芯片分析及RT-PCR验证　　本部分研究收集PBC及健康对照组外周抗凝血各30例，分离PBMC，从中各选取4例进行lncRNA表达谱芯片测定，旨在利用芯片筛选出PBC患者PBMC中差异表达的lncRNA，并用RT-PCR验证芯片结果。相比健康对照组，PBC组中共发现749个异常表达的lncRNA，其中541个上调，208个下调。230个异常表达的mRNA，其中184个上调，46个下调。从差异表达的lncRNA谱中选取6个(uc003xrr、uc010nhz、p1102447、NR_026777、ENST00000442026、ENST00000431157)扩大样本量验证芯片结果的可靠性，结果这6个差异的lncRNA在PBC组中的表达水平与芯片结果相符合。　　第二部分:lncRNA表达谱芯片生物信息学分析　　本部分主要通过对第一部分得到的749个差异lncRNA进行Cis-/Trans-靶基因的GO(Gene ontology，GO)、Pathway分析，以及构建lncRNA与mRNA的共表达网络图，分析这些异常表达的lncRNA参与的细胞功能和信号通路，为进一步探究lncRNA在PBC中的作用机制提供理论基础，指明研究方向。结果Cis/trans靶基因pathway分析提示这些差异表达的lncRNA作用的靶基因主要是与细胞凋亡及代谢途径相关。NR4A核受体亚家族广泛参与各种信号转导通路，如MAKP、NF-KB、PI3K/JNK、Wnt等，调控细胞凋亡、细胞增殖、细胞迁移、脂质代谢、血管形成以及DNA损伤修复等多种细胞生物学过程。纵观芯片中各基因的mRNA表达水平发现，其成员之一NR4A3基因的表达水平下调0.22倍，P值为0.0082。综合分析芯片上各位点的表达水平，发现NR4A3基因下游2万bp左右的位置处lncRNALOC441461的表达水平与其相反，上调2.56倍，P值为0.0015。综合三个权威数据库的结果确定LOC446C61为非编码RNA。在CatRapid网站在线预测LOC441461与PRC2复合物结合的可能性，结果发现在LOC441461的核苷酸序列第439-554核苷酸位置处存在PRC2复合物的结合位点，其中451-552位置处的辨识度高达94％，预示它们之间极有可能发生相互作用。因此，我们猜想PBC患者中LOC441461或许通过招募PRC2复合物，使NR4A3基因启动子区甲基化，进而下调NR4A3基因的表达水平，触发一系列生物学效应，促进疾病的发生发展。　　第三部分:linc-pbc靶点验证及功能探究　　本部分我们检测了linc-pbc和NR4A3在PBC组、疾病对照组和健康对照组中的表达水平，发现在PBC组中这两者的表达水平与芯片结果相符，P＜0.001，差异有统计学意义。在系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)患者中linc-pbc及NR4A3的表达模式与PBC类似，而乙肝肝硬化（Hepatitis B virus，HBV）患者中这二者的表达水平与对照组无显著性差异。设计siRNA对linc-pbc进行干扰，观察NR4A3、FOXP3的mRNA以及蛋白表达水平的是否有变化。同时检测转染siRNA后PBMC的凋亡情况。本研究发现转染针对linc-pbc的siRNA后，PBMC中linc-pbc的水平下降，而NR4A3的mRNA表达水平及蛋白质水平均上调，FOXP3的水平也上调，这说明linc-pbc可能确实可以通过与PRC2复合物结合，抑制NR4A3的表达;而NR4A3表达水平的降低将导致其调控转录的活性降低，进一步引起下游靶基因FOXP3的表达下调，导致循环外周血液及肝脏组织局部具有免疫抑制功能的Treg细胞减少，打破机体免疫耐受平衡状态，从而诱发疾病。但另一方面，转染siRNA后，细胞凋亡水平与阴性对照组并无明显差异，可能是由于转染的PBMC是从健康人中分离的，而这些健康人的细胞可能存在一定的损伤修复机制，单独干扰linc-pbc虽然可以使NR4A3的表达上升，但可能尚不足以引起明显的细胞凋亡现象。又或者，NR4A3仅仅促进自身反应性T淋巴细胞的凋亡。　　结论：PBC患者PBMC中，相对于健康对照组，共发现749个异常表达的lncRNA，其中541个上调，208个下调。230个异常表达的mRNA，其中184个上调，46个下调。NR4A3基因的表达水平下调0.22倍，P值为0.0082。在NR4A3基因下游的lncRNA LOC441461的表达水平与其相反，上调2.56倍，P值为0.0015。LOC441461或许通过招募PRC2复合物，使NR4A3基因启动子区甲基化，从而下调NR4A3基因的表达水平，而下调的NR4A3调控靶基因转录的活性降低，使得下游的靶基因FOXP3的表达下降，进而导致外周血及肝组织局部具有免疫抑制功能的Treg细胞数量减少，打破机体免疫耐受平衡状态，促进疾病的发生、发展。