真菌性病害对于柑橘产业危害十分严重,柑橘褐斑病（Alternaria brown spot,ABS）是一种柑橘生长期真菌性病害,由交链格孢菌橘致病型（Alternaria alternata tangerine pathotype）引起,侵染易感品种的嫩叶、嫩梢、幼果等幼嫩组织,产生坏死病斑,引起落叶落果。病原交链格孢菌,寄主范围十分广泛,其中导致柑橘褐斑病的是橘致病型,其产生的寄主专化性ACT毒素作为主要致病因子,作用于植物细胞的细胞膜。柑橘褐斑病在世界各地的柑橘主产区均有发生,对于部分敏感品种产生严重危害。在我国重庆、浙江、广东、广西等地都有柑橘褐斑病菌侵染爆发的报道,果园大量减产,柑橘产业损失惨重。目前,柑橘褐斑病菌全基因组测序已完成,基因功能的研究,有助于深入解析信号传导的分子机制,在控制病原菌传播侵染,开发靶标农药方面,具有重要意义。蛋白磷酸酶和蛋白激酶通过介导蛋白质位点的可逆磷酸化,调控胞内基因表达、信号通路传导。Yvh1是牛痘病毒VH1磷酸酶的同源蛋白,是模式作物酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中首个被鉴定的双位点特异性磷酸酶。在本研究中,我们通过比对酿酒酵母Sc Yvh1蛋白,Blast P柑橘褐斑病菌野生型蛋白组,得到同源蛋白AaYvh1（OWY42609.1）,确定其编码基因AaYvh1（AALTg125）。利用线上分析软件及开源数据库,对于目的蛋白AaYvh1的性质进行分析。进一步通过Split-Marker基因敲除技术获得交链格孢菌橘致病型中AaYvh1基因敲除盒,根据PEG介导原生质体转化的方法获得AaYvh1基因缺失突变体和回补菌株,对于AaYvh1基因功能进行初步探究。获得主要结论如下:1.酿酒酵母Sc Yvh1蛋白、稻瘟病菌Mo Yvh1蛋白和柑橘褐斑病菌AaYvh1蛋白的保守结构域分析结果显示,三个蛋白中都存在催化结构域,缺少识别底物作用结构域,主要通过催化结构域进行底物识别和相互作用。三个蛋白虽然整体结构类似,但是其催化结构域有较大差异,其活性中心的氨基酸组成和表面电势方面差异较大,AaYvh1蛋白的三级结构更为聚集。亚细胞定位结果显示,AaYvh1蛋白主要定位于微体中。微体是一种单层膜包裹的细胞器,在真菌中主要以包含氧化酶和过氧化氢酶的微体,AaYvh1基因可能参与柑橘褐斑病菌氧化酶和过氧化氢酶氧化的过程中。并且根据蛋白质的稳定性评价标准,AaYvh1蛋白预测较稳定,在氧化条件下蛋白不易改变。2.AaYvh1基因参与菌落营养生长和菌丝生长的调控。尤其是在营养匮乏情况下,AaYvh1基因的缺失导致营养吸收能力下降。同时,缺失AaYvh1基因改变了细胞壁的完整性,导致几丁质含量降低,缺失突变体对于细胞壁胁迫因子十二烷基磺酸钠敏感性增强,对于刚果红、荧光染料抗性增强。但AaYvh1基因在营养生长和细胞形态方面的缺陷并未体现在产孢上,AaYvh1基因的缺失不影响柑橘褐斑病菌产孢、孢子形态以及萌发率。3.AaYvh1基因的缺失影响菌株解毒ROS的能力,AaYvh1基因参与氧化胁迫的响应过程。在H2O2条件下,AaYvh1基因的表达量下降,基因表达受到抑制。基因缺失突变体ΔAaYvh1在含有氧化性物质H2O2、VK3、DEM的培养基上敏感性增强,生长受到抑制。在病原菌侵染植物过程中,AaYvh1基因的缺失导致参与胁迫响应的Hog1、Ptc1、Ypd1、Skn7、Ptp2基因的表达出现推迟。但同时,在刚果红培养基上,ΔAaYvh1产生的透明环与野生型相似,AaYvh1基因的缺失不影响过氧化物酶的分泌。4.ΔAaYvh1突变体分生孢子致病性减弱,表明AaYvh1基因参与致病性的调控。寄主专化性ACT毒素作为主要的致病因子,提取ΔAaYvh1突变体分泌的粗毒素接种于离体柑橘叶片上,相较于野生型,突变体粗毒素引起的叶片坏死斑减少,菌株毒力降低。接种于生长的红橘叶片上,菌株致病表型与离体叶片结果相同,进一步佐证了AaYvh1基因的缺失导致致病性减弱、粗毒素毒力减弱。在病原菌侵染植物过程中,AaYvh1基因的缺失导致ACT毒素相关基因ACTT2、ACTT3、ACTTS3、A-Tfo1、Cenp-B的表达延迟。