蛋白质组学的研究方法，主要依赖于分离技术和检测技术的突破性进展。2D-PAGE是目前最通用的蛋白质组的分离方法。但是2D-PAGE仍存在一些难以克服的缺陷，寻找2D-PAGE的替代技术是目前生物技术领域研究的一个热点。发展两维乃至多维色谱分离方法，可从根本上解决这个问题。 本研究以研究多维色谱分离方法为主要方向，搭建了一个纳升级的二维液相色谱分离平台，并将此用于人肝癌蛋白质组的分离与鉴定中，经过条件优化，发现该平台具有很好的分离能力，可以完全实现自动化，是一个无歧视性的蛋白质组分析平台。用此平台，鉴定出人肝癌蛋白质组中的229种蛋白，其中一些与肝癌的发病机理有关。同时发现在整个蛋白质鉴定中，多肽在LC中预测的保留数据可以辅助串级质谱鉴定出更多的蛋白，提高了鉴定的数量和鉴定的可靠性。并进一步对此LC保留模型进行了改进，使它更适合于预测大的肽段的保留，获得了满意的结果。 本研究共分三大部分，主要内容如下；1.肝癌(HepatocellularcarcinomaHCC)是全世界发病率最高的五大癌症之一。为了了解肝癌发现的机理，蛋白质组学提供了一个强有力的分析手段。搭建一个自动的纳升级全二维分离体系(nano2D-LC-ESI-MS/MS)用于分析HCC蛋白质组，其中强阳离子交换(SCX)为第一维，毛细管反相液相色谱(cRPLC)为第二维。使用这个系统，复杂样品的上样，除盐，分离和分析可以达到完全的自动化。经过分别对两维的条件优化，这个蛋白质组分析程序可以用于分离和鉴定大分子量的蛋白(＞100000)，小分子量的蛋白(＜20000)，强碱性的蛋白(pl＞9.5)和疏水性的蛋白，而这些蛋白在二维凝胶电泳上都不能得到很好的分离。最后运用这个系统鉴定了人肝癌细胞中229种蛋白。在它们中间，一些蛋白被发现与肝癌的发生和病变有关。并在此基础上，发展SEC-SCX-RPLC三维色谱分离模式。 2.二维液相色谱在线的偶联电喷雾串级质谱是蛋白质分离与鉴定的一个新平台。一般多肽首先由2D-LC进行分离，然后用ESI-MS/MS进行分析，最后用串级质谱产生的数据度对其进行鉴定。在一次2D-LC-ESI-MS/MS分析中不仅能够直接从质谱中得到多肽荷质比的信息(m/z)，而且也能够同时得到多肽在LC上的保留时间，而多肽的保留时间一直未能与串级质谱相联用来鉴定蛋白。在本研究中，发现用组成肽段的每个氨基酸的疏水性贡献对多肽在RPLC上的保留进行预测，从而可以使多肽的色谱信息辅助串级质谱鉴定蛋白。这样，蛋白可由四种类型的信息来鉴定，一是肽质量指纹图谱(PMF)，序列信息，MS/MS离子得分，预测的保留时间。这个附加的信息可辅助串级质谱鉴定蛋白，鉴定率提高了16％，而且不需要花费额外的费用。 3.小肽的保留可以通过组成多肽的每个氨基酸的疏水性贡献的加和来预测。但当多肽的长度大于10-15残基时，多肽的保留时间要小于氨基酸残基的保留系数相加得到的预测结果。在本章中，考虑多肽的长度和每个氨基酸残基与固定相的接触面积，提出了一个新的预测模型。对这个模型用实验数据和文献数据进行验证，发现运用新模型可以提高预测的精度。而且也支持了最初的假定，对于小肽，氨基酸的组成控制着它的保留。但对大的肽段来说，肽链的长度和每个氨基酸与固定相接触的面积是影响保留的重要因素。而且，多肽链的范围越宽，预测精度越好。同时发现非级性、极性和带电荷氨基酸与固定相接触的面积的比率都小于1。