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γ-聚谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid)是一种重要的天然聚合物,由于其具有良好的性质已被广泛应用于食品,化妆品,医药,材料等领域。Bacillus amyloliquefaciens LL3是一株谷氨酸非依赖型γ-PGA合成菌。为了提高其γ-PGA产量,本研究计划对此菌株进行了代谢工程改造。本研究代谢改造策略主要包括三部分:模块化代谢通路改造;蔗糖代谢途径改造;谷氨酸合成途径改造。利用模块化通路改造策略对γ-PGA合成相关的八个代谢通路进行改造包括:γ-PGA降解相关途径;细胞呼吸链;胞外蛋白及胞外蛋白酶合成途径;细菌多糖合成途径;次级小分子代谢产物合成途径;细胞自诱导因子合成途径;谷氨酸合成途径以及γ-PGA合成途径。最终整合获得的最优基因工程菌株NK-anti-rocG(敲除了epsA-O操纵子(负责胞外多糖合成),sac操纵子(负责果聚糖合成),lps(脂多糖合成相关),pta(乙酸合成相关),pgdS(γ-PGA降解酶),cwlO(细胞壁水解酶),luxS(AI-2合成)以及表达anti-rocG sRNA(抑制谷氨酸脱氢酶表达))γ-PGA摇瓶发酵产量从3.8 g/L提高到11.04 g/L,较对照菌株提高了2.91倍。γ-PGA产物纯度也从78.6%提高到95.2%。5-L罐补料分批发酵实验得到NK-anti-rocG菌株产量可达20.3 g/L。本研究通过两种方式对B.amyloliquefaciens蔗糖代谢途径进行改造。将原始菌株的诱导型蔗糖代谢途径改造成组成型蔗糖代谢途径并没有提高γ-PGA产量;然而,将原始菌株蔗糖代谢途径替换成异源的能量节约型蔗糖代谢途径,得到的3Δ-CES工程菌株γ-PGA产量较对照菌株提高了38.5%。本研究利用新的代谢改造策略对B.amyloliquefaciens谷氨酸合成途径进行了改造。引入能量节约型谷氨酸合成途径的NK-1(pHT315-gdh)菌株,γ-PGA产量较对照菌株提高了9.14%。引入代谢开关的NK-PO1(pHT01-xylR)菌株,γ-PGA产量较对照菌株提高了66.2%。