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传统治疗性肿瘤疫苗大多是靶向特定抗原起效,然而由于抗原覆盖度低等原因,其治疗效果并不理想。全细胞疫苗能诱导机体靶向该肿瘤细胞所表达的大部分抗原,但全细胞疫苗存在诸如免疫排斥反应（同种异体来源）、不适用于难以手术患者（自体来源）等问题。肿瘤原位疫苗,因具有抗原覆盖程度广、不存在排异反应、肿瘤和患者类型选择面广、给药方式简单等优势而备受关注。但目前对原位疫苗的研究仍然较少,存在许多问题亟需解决:1)抗原递呈细胞（antigen presenting cells,APCs）对肿瘤抗原摄取不足;2)肿瘤抗原被APCs摄取后大多被限制在溶酶体中,难以被MHC I分子递呈,致使CD8+T细胞激活不足;3)肿瘤的免疫抑制微环境限制了效应T细胞发挥抗肿瘤效力。因此,如何在保留原位疫苗优势条件下,克服现有原位疫苗的不足,是本课题拟解决的关键问题。针对现有原位疫苗不足,本课题提出以下解决方案:1)本课题拟利用多柔比星（doxorubucin,DOX）的免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）效应,加速肿瘤抗原的产生,然后利用表面修饰Mal基团的脂质体捕获抗原,并通过靶向配体甘露糖的修饰提高树突细胞（dendritic cells,DCs）对脂质体的吞噬,以提高DCs对抗原的摄取量。2)将DLin-MC3-DMA作为上述脂质体主要成分,赋予该脂质体以溶酶体逃逸能力,提高抗原经MHC I递呈的几率。同时加入STING激动剂（cGAMP）作为免疫佐剂,加速DCs成熟,促进CD8+T细胞活化;3)加入1-甲基-D-色氨酸（1-methyl-D-tryptophan,1MT）抑制吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO）活性,降低调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）含量,提高效应T细胞活力,逆转肿瘤免疫抑制微环境,提高疫苗治疗效果。上述解决方案的实现需要将以上成份有效递送至肿瘤组织内部。然而,由于肿瘤组织复杂生理结构导致纳米药物大多在肿瘤外围堆积,肿瘤渗透性差已成为目前纳米药物临床转化率低的主要原因之一。在影响纳米药物肿瘤渗透性的因素中,粒径和电位被认为是最关键因素。研究表明,小粒径（＜50nm）、荷正电纳米粒更易于肿瘤深层渗透。基于以上讨论,本课题主要开展了以下研究:第一部分:变身小纳米粒实现肿瘤深层渗透的研究本课题首先对小粒径、荷正电纳米粒的肿瘤深层渗透能力进行验证。考虑到荷正电纳米粒在血液循环中易被网状内皮系统清除,本部分利用具有pH敏感特性的二甲基马来酸酐对小粒径PAMAM纳米粒进行修饰得到了变身小纳米粒（PAMAM-Dimethylmaleic anhydride,PDMA）。PDMA在血液循环中表面保持负电性,但到达肿瘤组织后可响应肿瘤微酸环境发生电荷的翻转,进而实现肿瘤深层渗透。本部分成功合成了四种变身小纳米粒,并对其pH敏感电荷翻转性能进行考察筛选出适宜的变身小纳米粒PDMA。结果表明PDMA具有优异的pH响应性电荷翻转性能,可以在pH 6.5条件下响应性转变为小粒径、荷正电纳米粒。体外细胞摄取与肿瘤渗透实验结果表明,PDMA在pH 6.5比pH 7.4更容易被肿瘤细胞摄取且肿瘤深层渗透效果更好。体内实验结果表明PDMA具有很好的肿瘤组织蓄积能力和肿瘤深层渗透能力。对装载DOX的纳米小粒PDMA/DOX的抑瘤效果和安全性进行评价,结果表明PDMA/DOX具有较好的肿瘤抑制效果并且初步安全性良好。最后,对PDMA的肿瘤渗透机制进行考察,结果表明PDMA主要是通过小窝介导的转胞吞作用实现肿瘤深层渗透。第二部分,双转换纳米递送系统原位构建自组装疫苗用于肿瘤免疫治疗的研究根据本论文针对现有原位疫苗的改进方案,结合第一部分对纳米粒肿瘤渗透性的研究结果,第二部分设计了粒径可变、电荷可翻转的双转换纳米递送系统（NGR-modified LCL/DM and MCL/G co-loaded nanoparticles,NLM/DMG）,用于在肿瘤原位构建自组装疫苗,以增强原位疫苗的抗肿瘤效果。荷负电的NLM/DMG可在靶向配体NGR介导下主动靶向到肿瘤组织。到达肿瘤组织后,由于肿瘤微酸环境而发生响应性解聚,释放出共载 DOX 和 1MT 脂质体（LHRH-modified cationic liposome loaded with DOX and 1MT,LCL/DM）和单载 cGAMP 脂质体（Mannose-modified cationic liposome loaded with cGAMP,MCL/G）。由于小粒径且荷正电,LCL/DM和MCL/G可以深层渗透到肿瘤内部。LCL/DM在靶向配体 LHRH（Luteinizing hormone-releasing hormone analogs）介导下主动靶向肿瘤细胞,并释放出DOX和1MT。DOX发挥ICD效应促进肿瘤抗原释放,这也是原位构建自组装疫苗（In situ constructed self-assembled vaccines,ICSV）的起始阶段。随后,MCL/G通过其表面马来酰亚胺（Maleimide,Mal）捕获肿瘤抗原,自组装成ICSV。ICSV被DCs摄取,并促进抗原和cGAMP的溶酶体逃逸,增加肿瘤抗原经MHC I递呈的几率,增加CD8+T细胞的活化量。在效应T细胞发挥作用阶段,1MT可以有效抑制肿瘤组织中IDO活性,逆转免疫抑制微环境,有利于效应T细胞充分发挥抗肿瘤作用。本部分合成靶向材料,并成功组装了 NLM/DMG。结果表明,NLM/DMG的粒径均一、电位符合要求,并具备pH响应性粒径缩小与电荷翻转的双转换能力,肿瘤深层渗透能力好。体内外靶向性考察表明,NLM/DMG具有很好的肿瘤主动靶向及异靶点递送能力。对ICSV的组装机制考察,结果表明MCL/G具有较强的抗原捕获能力,可以成功组装成ICSV,提高DCs的摄取,促进抗原和cGAMP的溶酶体逃逸,并有效促进DCs成熟。免疫相关评价表明,NLM/DMG可以发挥ICD效应,激活cGAS-STING通路,有效抑制了 IDO活性,较好地逆转了肿瘤免疫抑制微环境。体内治疗效果评价表明,NLM/DMG可以有效抑制肿瘤生长,对肿瘤术后复发和肺转移具有优异的抑制作用。并可以刺激效应记忆T的生成,有效抑制再挑战肿瘤的生长,具有潜在长期免疫抗肿瘤效果。综上,本课题:1)证实了小粒径、荷正电纳米粒具有很好的肿瘤深层渗透能力,且其主要通过小窝介导的转胞吞作用实现肿瘤深层渗透;2)构建的NLM/DMG可以实现粒径和电荷双转换,具有肿瘤深层渗透和异靶递送能力,可实现原位肿瘤疫苗的自组装;3)提出了 ICSV肿瘤疫苗构建新策略,联合1MT与cGAMP,增强ICSV的抗肿瘤免疫效果。