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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是以损害滑膜、软骨和骨为主的系统性自身免疫疾病。其病程体现了自身免疫反应、细胞因子炎症及滑膜增生等主要病理过程。单核细胞和巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在RA滑膜炎中发挥重要作用。TNF-α有两个受体,TNF受体1(TNFreceptor1, TNFR1)含有死亡结构区域,主要介导细胞的凋亡;而TNFR2没有死亡结构区域,主要通过肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor-associatedfactor2, TRAF2)连接的信号通路调节细胞的存活、活化和增殖。在RA患者血清及关节滑膜中均可测到TNF-α浓度升高,国内外研究表明阻滞TNF-α的作用能显著改善患者的临床症状,提高生活质量。重组人肿瘤坏死因子受体和人IgG-Fc段融合蛋白(recombinant human TNFR:Fc, rhTNFR:Fc),能够特异性结合两分子TNF-α,阻断TNF-α与细胞表面受体结合,从而抑制TNF-α生理活性,用于治疗难治性RA,并且rhTNFR:Fc联合传统免疫抑制剂甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)治疗时表现出显著的疗效,但具体分子机制不明。已知TNFR2多表达于CD4+辅助性T(helper T, Th)细胞,Th细胞从中枢淋巴器官发育成熟后迁移到外周免疫器官,并通过分泌不同的细胞因子在RA的发生发展过程中发挥重要作用。其中,T细胞亚群比例的失衡及炎性细胞因子产生的免疫损害,是导致RA慢性炎症的关键因素。因此,rhTNFR:Fc和MTX联合使用对T细胞分化和功能的影响有待深入探讨。本课题组前期研究发现TNF-α体外刺激胶原性关节炎(collagen-inducedarthritis, CIA)大鼠的滑膜细胞,引起前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)受体(E-prostanoid receptor, EP)4信号通路发生异常变化,抑制滑膜细胞EP4的表达,降低环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水平,促进滑膜细胞的增殖。EP4受体为典型的G蛋白偶联受体(G preotein coupled receptor,GPCR),与兴奋性G蛋白(stimulatory guanine nucleotide-binding protein, Gαs)偶联,升高cAMP水平。G蛋白偶联受体激酶(G-protein-coupled receptor kinases,GRKs)和β-arrestin2是GPCR的重要调节分子。然而TNF-α究竟如何调节EP4信号通路,促进滑膜细胞异常增殖的分子机制尚不明确。本研究旨在观察rhTNFR:Fc联合MTX对小鼠CIA的治疗作用及对T细胞增殖、分化和功能的影响;并且在以往工作的基础上,进一步阐明TNF-α调节EP4受体信号促进人成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte, FLS)过度增殖的分子机制,为揭示TNF-α参与RA病程的分子病理机制提供理论依据。目的:观察rhTNFR:Fc联合MTX对小鼠CIA的治疗作用及对T细胞功能的影响;揭示TNF-α调节EP4信号通路,诱导人FLS异常增殖的分子机制,以深入阐明TNF-α参与RA病程的分子病理机制。方法: DBA/1小鼠于d0和d21,尾根部、背部多点皮内注射100μg鸡Ⅱ型胶原乳剂诱导小鼠CIA模型。造模成功的DBA/1小鼠,随机分为5组,即正常组、模型组、rhTNFR:Fc组(4.5mg/kg/次,皮下注射,三天一次,用药15天(5次))、MTX组(2mg/kg,灌胃,每三天一次,用药5次)、rhTNFR:Fc(4.5mg/kg/次,皮下注射,三天1次,用药15天(5次))和MTX(2mg/kg,灌胃,每三天一次,用药5次)联合用药组。d41处死小鼠,观察关节炎指数评分,关节和脾脏病理检查及病理学评分,胸腺指数和脾指数;3H-TdR掺入法观察各给药组对T淋巴细胞增殖功能的影响;ELISA法检测培养上清中TNF-α、淋巴细胞毒素-α(lymphotoxin, LT-α)、IL-1β、核因子κB受体活化因子配体(receptor activatorfor nuclear factor-κB ligand, RANKL)、IL-10、IL-17、IL-6和干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)水平;流式细胞术检测胸腺、脾脏T淋巴细胞各亚群比率的变化情况。组织块培养法培养人FLS;环氧化酶抑制剂吲哚美辛(Indometacin, INN)抑制TNF-α诱导的PGE2的产生;MTT法检测TNF-α介导的人FLS细胞的增殖情况;流式细胞术检测胞膜TNFR1和TNFR2受体表达;放免法检测细胞内cAMP浓度;Western blot法检测TNF-α介导的TNF-α信号通路和G蛋白偶联信号中TRAF2、Gαs总蛋白、活性Gαs、EP4、GRK2分布情况;siRNA瞬时沉默人FLS中TRAF2基因表达,Western blot和逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)法鉴定干扰效果;RT-PCR检测EP4的mRNA水平;免疫共沉淀法检测TRAF2与GRK2或β-arrestin2的结合情况;ELISA法检测细胞培养上清中PGE2的浓度。结果:1rhTNFR:Fc联合MTX对小鼠CIA的治疗作用1.1rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠关节炎指数的影响d26小鼠足爪出现较明显红肿,CIA组足爪红肿逐渐加重。d35-d40,MTX(2mg/kg)和rhTNFR:Fc(4.5mg/kg)+MTX(2mg/kg)联合用药组可显著降低CIA小鼠关节炎指数;d38开始,rhTNFR:Fc(4.5mg/kg)可显著降低CIA小鼠关节炎指数。其中,联合给药组降低关节炎指数作用较rhTNFR:Fc组显著,与MTX组比无显著性差异。1.2rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠足爪和脾脏病理变化的影响CIA小鼠关节腔可见滑膜组织增生,衬覆多层滑膜细胞,炎性细胞浸润,血管扩张充血,血管翳出现,甚至出现骨和软骨破坏。rhTNFR:Fc、MTX和联合用药组可不同程度的抑制小鼠关节滑膜细胞增生、炎细胞浸润、血管扩张充血、血管翳生成等病理变化,显著降低病理评分;其中,联合给药组对滑膜炎症的抑制作用较rhTNFR:Fc组更强,对滑膜增生的抑制作用较MTX组更强。CIA小鼠脾脏可见白髓增生,表现为蓝染的淋巴细胞聚集区变大,生发中心出现;红髓增生,淤血,范围增大。rhTNFR:Fc、MTX和联合给药组可不同程度改善脾脏病理变化,白髓增生减轻或接近正常,红髓充血减轻,减少生发中心。其中,联合给药组对各项脾脏病理变化的改善作用较rhTNFR:Fc组更显著,对淋巴滤泡增生的抑制作用较MTX组更明显。1.3rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠胸腺和脾脏指数的影响与正常组相比,CIA小鼠胸腺和脾脏明显肿大,指数增加。rhTNFR:Fc和联合给药组对脾脏和胸腺指数均有明显抑制作用,两组之间没有显著性差异;MTX组可以显著降低胸腺指数,但对脾脏指数没有显著影响。1.4rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响ConA诱导的CIA小鼠胸腺T淋巴细胞增殖反应明显增强,rhTNFR:Fc、MTX和联合给药组均可明显抑制T淋巴细胞增殖反应,各给药组间没有显著性差异。1.5rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠血清和巨噬细胞培养上清细胞因子的影响与正常组相比,CIA小鼠血清IL-1β、TNF-α、RANKL和IL-6水平明显升高,IFN-γ水平明显降低。MTX组和联合给药组可显著抑制血清中IL-1β、IL-6表达;rhTNFR:Fc组和联合给药组可显著抑制血清中TNF-α、RANKL表达;各给药组对血清降低的IFN-γ水平没有显著影响。其中,联合给药组对血清IL-6的降低程度优于rhTNFR:Fc或MTX单用,各给药组之间对其它细胞因子作用没有显著性差异。与正常组相比,CIA小鼠巨噬细胞培养上清IL-17、LT-α水平显著升高,IL-10浓度降低。rhTNFR:Fc、MTX和联合给药组可显著降低巨噬细胞培养上清IL-17、LT-α表达,MTX和联合给药组显著升高IL-10浓度;但各给药组之间没有显著性差异。1.6rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠胸腺、脾脏T细胞亚群的影响与正常组比较,CIA组胸腺和脾脏CD4+/CD8+T细胞比例、总Th细胞(CD3+/CD4+)和活化Th细胞(CD4+/CD25+)比例均显著升高,未致敏Th细胞(CD4+/CD62L+)和Treg细胞(CD4+/CD25+/Foxp3+)比例显著降低。rhTNFR:Fc组、MTX组和联合给药组均可明显降低胸腺和脾脏CD4+/CD8+T细胞比例,且联合给药组降低脾脏CD4+/CD8+T细胞比例程度明显优于单用药组。rhTNFR:Fc组和联合给药组可显著降低胸腺总Th细胞、活化Th细胞比例,升高未致敏Th细胞、Treg细胞比例,联合给药组升高Treg细胞比例程度明显优于MTX组。rhTNFR:Fc组、MTX组和联合给药组可显著降低脾脏总Th细胞、活化Th细胞比例,升高未致敏Th细胞比例;rhTNFR:Fc组和联合给药组显著升高Treg细胞比例,且联合给药组升高Treg细胞比例的作用强于MTX组。2TNF-α调节人滑膜细胞前列腺素受体EP4信号的机制2.1TNF-α体外对人FLS增殖功能的影响TNF-α刺激人FLS增殖的亚适浓度为20ng/ml,作用最强在48h。TNF-α(20ng/ml)或TNF-α+INN(20ng/ml+1×10-6mol/L)刺激正常人FLS发现均可使细胞内cAMP水平显著降低,细胞增殖功能亢进。2.2TNF-α体外刺激人FLS后TNF-α信号通路的变化TNF-α刺激正常人FLS后,TNFR2表达水平明显升高,但TNFR1表达无显著变化;TRAF2总蛋白的表达水平显著增加,且TNF-α+INN比TNF-α增加更明显。2.3TNF-α体外对人FLS内G蛋白偶联信号中Gαs总蛋白、活性Gαs蛋白、总EP4及胞膜和胞浆EP4蛋白表达的影响由于EP4是通过偶联Gαs激活AC从而调节cAMP水平,因此我们检测TNF-α或TNF-α+INN处理后细胞中总Gαs蛋白、活性Gαs蛋白、总EP4蛋白及胞膜和胞浆EP4蛋白的表达。结果显示,TNF-α或TNF-α+INN显著增加了总EP4,胞浆EP4蛋白和EP4基因的表达;同时,显著降低了胞膜EP4蛋白的表达;进一步的结果发现,TNF-α组或TNF-α+INN组明显减少了活化Gαs蛋白的表达,而总Gαs蛋白表达无显著变化。2.4TNF-α通过TRAF2与GRK2偶联,调节胞膜GRK2蛋白的水平影响人FLS内G蛋白偶联信号为了探讨TNF-α如何通过其下游的分子降低cAMP水平,促进EP4受体的脱敏和内吞,我们进一步使用免疫共沉淀法检验TRAF2是否与GRK2或β-arrestin2蛋白偶联。结果发现TRAF2和GRK2或β-arrestin2均发生了相互作用,并且正常情况下人FLS中TRAF2-GRK2的相互作用较强,而当TNF-α或TNF-α+INN刺激后,相互作用的TRAF2和GRK2水平显著下降。进一步结果显示胞膜上的GRK2表达在一个较高的水平。TRAF2和β-arrestin2的偶联没有显著改变。2.5TNF-α体外对人FLS内PGE2水平的影响由于TNF-α可以诱导人FLS中PGE2的产生,我们检测了TNF-α或TNF-α+INN刺激后,细胞培养液中PGE2的浓度。结果显示,由TNF-α处理后的细胞培养上清中PGE2的浓度显著增加,而TNF-α+INN能显著减少PGE2的浓度。2.6干扰TRAF2表达后对TNF-α促进人FLS增殖功能的影响用siRNA法干扰人FLS中TRAF2表达后,细胞内TNF-α或TNF-α+INN刺激后cAMP水平显著升高,增殖能力均明显减弱,且TNF-α+INN几乎失去了引起细胞增殖的能力。2.7干扰TRAF2表达后对TNF-α引起人FLS内总EP4蛋白及胞膜和胞浆EP4、GRK2蛋白表达改变的影响干扰TRAF2表达后,总EP4蛋白表达水平和胞膜EP4蛋白表达水平明显地增加,而胞浆EP4蛋白,基因表达水平显著降低;TRAF2-GRK2偶联明显逐渐减弱,胞膜上GRK2蛋白显著降低,胞浆GRK2蛋白明显增加。2.8干扰TRAF2表达后对TNF-α刺激人FLS产生PGE2水平的影响干扰TRAF2表达后,TNF-α或TNF-α+INN对TNF-α诱导的PGE2产生没有显著性影响。结论:1. CIA小鼠T淋巴细胞增殖异常;血清中IL-1β、RANKL、TNF-α、IL-6表达均增高,IFN-γ水平降低,巨噬细胞培养上清中IL-17、LT-α表达升高,IL-10表达降低;脾脏和关节发生病理改变;胸腺和脾脏CD4+/CD8+T细胞比例、总Th细胞和活化Th细胞比例均显著升高,未致敏Th细胞和Treg细胞比例显著降低。rhTNFR:Fc、MTX及rhTNFR:Fc+MTX联合给药组通过抑制CIA小鼠T淋巴细胞异常增殖,调节细胞因子水平和T淋巴细胞亚群比例的平衡,对CIA小鼠上述症状具有不同程度的治疗作用,并且联合给药在关节炎指数、滑膜炎症、滑膜增生、各项脾脏病理变化、淋巴滤泡增生、血清IL-6、胸腺和脾脏Treg细胞以及CD4+/CD8+比例程度等方面较单用MTX或rhTNFR:Fc对小鼠CIA的治疗作用更明显。2. TNF-α可以显著促进人FLS的增殖,其机制不仅与TNF-α的受体偶联信号有关,且与其调节PGE2-EP4-Gαs-cAMP信号转导有关。正常FLS中,TRAF2和GRK2相互结合,TNF-α刺激可上调TRAF2总表达,使其与GRK2分离,促进GRK2转膜,引起EP4受体脱敏和内吞,降低cAMP水平。