论文部分内容阅读
猪传染性胃肠炎（Porcine transmissible gastroenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起猪的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性、急性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病。由于TGEV的致病机理至今还不清楚，且TGEV易发生基因重组现象，又能与其他病毒或是细菌常发生混合感染和继发感染，因此给临床诊断和疫苗研发带来了困难。ORF7编码TGEV的非结构蛋白，现有的资料证明，ORF7能抵抗宿主的抗病毒反应，调节病毒毒力，但ORF7的亚细胞定位、对病毒增殖、毒力调节的作用机制仍然不清楚。本研究建立了检测猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法，并进行了ORF7蛋白亚细胞定位、ORF7过表达后对病毒增殖、复制的研究，获得了以下结果：（1）RT-PCR扩增出TGEV的N基因，与克隆载体pEASY-T1连接后构建质粒标准品。对荧光定量的循环条件进行优化，成功绘制出标准曲线，建立了猪传染性胃肠炎病毒Real-time PCR检测方法，该方法特异性高、重复性好，敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级，对质粒标准品的线性检测浓度为1.0×101～1.0×107拷贝/μL。（2）RT-PCR扩增出TGEV ORF7，并连接到表达载体GFP上，PCR扩增、酶切、测序鉴定后得到了正确的重组质粒GFP-ORF7和ORF7-GFP；重组质粒转染细胞，经RT-PCR扩增得到了234bp的条带，Western blot检测得到了约9ku的目的蛋白，与预期结果相符，说明ORF7在细胞内正确表达。（3）重组质粒转染ST细胞，染色，进行激光共聚焦和信号肽预测。结果表明，GFP与ORF7蛋白的融合位点影响ORF7蛋白的亚细胞定位，且在ORF7蛋白的-NH2端约1～30个氨基酸处有信号肽的存在。（4）转染重组质粒的ST细胞感染TGEV后34h进行N基因和病毒含量的Real-timePCR检测。结果显示，过表达ORF7后TGEV N基因表达量明显下调，病毒含量降低。本研究建立了TGEV Real-time PCR检测方法，能对TGEV进行快速检测。首次确定了ORF7蛋白的亚细胞定位特点，初步发现过表达ORF7后能引起病毒N基因表达量的下调，病毒含量降低。这些研究内容和结果为今后开展TGEV ORF7的深入研究提供了资料。