赭曲霉培养基筛选及AopacC基因对生长和产毒调控的功能研究

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赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是由青霉属和曲霉属产生的次级代谢产物,广泛分布在粮食、水果、饲料、咖啡和动物性副产品中,被国际癌症研究机构(IARC)列为2B类潜在致癌物,严重威胁人类健康和食品安全。有效防控农产品OTA污染的关键是解析OTA合成途径及其合成调控机理。Pac C作为p H调控通路中的关键因子,参与多种生命活动,调控毒素合成,但目前对赭曲霉中Pac C的功能研究尚未见报道。本文研究了赭曲霉在不同培养基上的生长特性和Aopac C基因在赭曲霉p H应答中的作用,研究发现:(1)赭曲霉在不同培养基上产毒差异较大:固体培养基中,赭曲霉在YES培养基上产毒量较高且菌丝发达,OTA达到36.09 ng/mm2培养基,可以用YES培养基来进行赭曲霉生理特性的研究;天然培养基中,OTA产量最高的是玉米渣培养基,OTA产量达到251.67μg/g,可以用来进行OTA毒理和产毒规律等研究;赭曲霉在液体培养基中的产毒十分微弱且只在YES培养基中产毒,OTA产量仅为15.39ppb。此外,研究发现固体培养基上OTA的提取宜采用方便快捷、回收率高的甲醇直接提取法,而在液体中OTA的提取宜选用氯仿萃取法。(2)本研究运用同源重组原理和PEG诱导的方法对赭曲霉Aopac C基因进行敲除:通过PCR扩增获得Aopac C上下游片段和潮霉素片段,采用巢式PCR对三个片段进行融合,将融合目的片段转入赭曲霉原生质体中,通过潮霉素抗性筛选,成功获得赭曲霉3个转化子,经PCR鉴定均为非异位Aopac C突变体,分别命名为:⊿Aopac C22-1、⊿Aopac C-3、⊿Aopac C-5。(3)对Aopac C进行功能分析时发现,⊿Aopac C与野生型相比,生长缓慢,OTA合成量减少,致病性显著降低,并且呈现出p H依赖性。研究赭曲霉中全局调控基因和基因簇内基因的表达情况时发现,与野生型对比,突变体中的OTA合成簇中的关键基因(Aopks,Aobzip,Aohalogenase)的表达都显著下调,但是全局调控基因的表达在不同p H下表现出差异性,推测Aopac C是通过调控OTA合成相关基因的表达来实现对OTA的调控。此外,本文研究了p H对赭曲霉生长及代谢的影响:p H对赭曲霉孢子产量和菌丝形态没有显著影响,但对其生长、产毒和基因表达都具有调控作用,在p H6条件下赭曲霉生长和产毒均达到最大。
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