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慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)是西方国家最常见的白血病。据最新SEER统计,其发病率为4.7/100000,男性发病多于女性(约1.9:1),5年生存率约为87.9%。本病常发生于老年患者,诊断中位年龄为70岁,以临床病程多变并容易复发为特征。Del(17p)/TP53突变、NOTCH1突变、CD49d、免疫球蛋白重链可变区基因(Immunoglobin Heavy Chain Variable Region)IGHV 突变状态、复杂核型和 Rai 和Binet分期系统对判断临床预后指导决策具有重要价值。新型药物,包括B细胞受体BCR信号通路抑制剂(ibrutinib、acalabrutinib、idelalisib 和 duvelisib)和抗凋亡蛋白 BCL-2抑制剂(venetoclax),与传统的免疫疗法相比具有优越性。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和异体干细胞移植(allogenetic stem cell transplant,allosct)可以用于高危患者的细胞免疫治疗。近年来研究发现,许多基因异常表达与疾病的进展过程及化疗耐药性有关。因此临床亟待寻求新的治疗靶点克服CLL的复发与耐药问题。核仁纺锤体相关蛋白 1(Nucleolar and spindle associated protein 1,NUSAP1)是一种分子量为55KD的微管结合蛋白,它结合微管并主导有丝分裂进程、纺锤体形成和稳定,是一种在有丝分裂过程中调控正常细胞周期的重要分子。此外,NUSAP1参与了很多癌症的发展、进展和转移。研究发现,在前列腺癌、乳腺癌、口腔鳞状细胞癌和宫颈癌中存在NUSAP1表达异常增加,并与患者不良预后相关。并且NUSAP1被认为是口腔鳞癌、食管鳞癌、宫颈癌、乳腺癌、肝细胞癌和前列腺癌的候选生物标志物。上调NUSAP1 可通过调控 Wnt/β-catenin、Hedgehog、PI3K/AKT、Hippo/yap1 等信号通路促进肿瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进侵袭转移。尽管NUSAP1开始被广泛研究,然而其在CLL中的作用和机制尚不清楚。研究发现,DNA损伤是一种频繁发生的现象,并在癌症发展中起着重要作用。DNA损伤反应缺陷是导致正常细胞获得致癌突变的主要因素。然而,肿瘤发生后,恶性细胞适应各种机制,如修复未经检查的DNA复制造成的DNA损伤,以管理它们的生存。DNA修复过程发生在DNA损伤后的一系列复杂过程,有助于维持基因组的保真度,而癌细胞对临床治疗中放疗或化疗诱导的DNA损伤修复能力将影响治疗效果。CLL细胞的DNA修复,这被认为是一种潜在的耐药机制,限制了化疗的细胞毒性作用。基于这些前提,抑制DNA修复过程最近被认为是一种很有前途的治疗癌症的方法。本研究以NUSAP1在CLL细胞株及临床标本的异常表达为切入点,通过慢病毒转染干预NUSAP1的表达水平,进一步探究NUSAP1在CLL细胞生长中的生物学作用,并深入探讨NUSAP1如何调控DNA损伤修复通路影响CLL细胞耐药的分子机制,为探索CLL治疗的新靶点及改善化疗耐药的治疗策略提供理论依据。第一部分:NUSAP1在慢性淋巴细胞白血病发生发展中的临床意义及生物学功能目的:近期研究表明,NUSAP1在多种癌症中存在异常高表达,并与患者不良预后相关,然而NUSAP1在CLL中的作用与临床意义尚不清楚。本研究旨在检测NUSAP1在CLL细胞株及患者原代细胞中的表达水平,分析与患者临床预后的关系,初步探讨其临床意义。此外,通过RNA测序技术,分析NUSAP1在CLL细胞中富集的细胞生物过程及信号转导通路,预测其生物学作用。从而通过病毒转染技术双向调控NUSAP1表达水平,并在体外实验中进一步验证并探讨NUSAP1对CLL中细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期所产生的影响。材料与方法:1.利用GEO数据库分析CLL患者NUSAP1相关生物学信息;2.病例标本采集;3.人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)提取;4.免疫磁珠分选CD19+B细胞;5.CLL细胞培养;6.RNA提取、逆转录及实时荧光定量聚合酶链式反应;7.提取蛋白和蛋白质免疫印迹检测(Western Blotting,WB);8.慢病毒载体介导的NUSAP1基因的沉默及过表达;9.RNA 测序(RNA-sequencing,RNA-seq)技术;10.Annexin V-PE/7AAD法检测细胞凋亡;11.Cell Counting Kit-8(CCK8)检测细胞增殖;12.PI/Rnase法检测细胞周期;13.CLL异种移植小鼠模型建立;14.统计学分析。结果:1.实时荧光定量PCR和Western Blotting结果显示,与健康志愿者B细胞相比,所纳入的51例CLL病例标本及CLL细胞株(MEC-1、EHEB)中NUSAP1在mRNA和蛋白水平均存在异常高表达(p<0.001)。2.NUSAP1高表达与白细胞计数增加、Binet高级别分期、Rai高风险分期、β 2-微球蛋白升高、IGHV未突变、11q/17p缺失/Tp53突变等不良预后指标相关。在GSE22762数据库中,NUSAP1在mRNA的表达水平与患者总体生存率存在显著性差异(HR=3.15,p<0.05)。3.在RNA测序结果中,KEGG通路富集分析结果显示,NUSAP1在与癌症相关的通路中富集如DNA修复通路、PI3K-AKT信号通路、p53信号通路及细胞周期信号通路等。GO功能富集分析显示,NUSAP1与细胞增殖、细胞周期、刺激反应等生物学过程密切相关。GSEA基因富集分析提示,NUSAP1与DNA复制、错配修复、核苷酸切除修复、碱基切除修复、同源重组、细胞周期等方面相关。4.利用慢病毒转染CLL细胞株双向调控NUSAP1表达,与对照组相比,shNUSAP1组细胞增殖活性明显降低(p<0.01),凋亡细胞显著增多(p<0.01),细胞周期阻滞于G0/G1期(p<0.01)。5.体内实验证明,皮下种植shNUSAP1的细胞的成瘤大小显著低于shControl组(p<0.01)。结论:NUSAP1在CLL病例标本及细胞株中表达异常增高,并与患者不良预后相关。通过RNA测序分析预测,NUSAP1可能通过参与细胞DNA损伤修复、细胞凋亡、周期调控等功能促进CLL的发生与发展。进一步敲减NUSAP1后,CLL细胞的增殖活性降低,凋亡增加,G0/G1期细胞周期阻滞,抑制小鼠皮下成瘤生长。阐明NUSAP1在CLL体内外的生物学功能及作用机制,将为寻找CLL相关的新靶点及改善治疗提供新的理论依据。第二部分:NUSAP1靶向DNA损伤修复通路调节慢性淋巴细胞白血病细胞的耐药性目的:近年来,CLL细胞的DNA修复,这被认为是一种潜在的耐药机制,限制难治性/复发性CLL患者的临床治疗效果。抑制DNA修复过程最近被认为是一种很有前途的治疗癌症的方法。本研究旨通过慢病毒转染技术调控NUSAP1在CLL细胞中的表达,进一步探究NUSAP1对下游细胞信号通路及细胞耐药的影响机制,从而为寻求新的治疗靶点克服CLL的复发与耐药问题提供理论依据。材料和方法:1.CLL细胞系培养;2.慢病毒载体介导的NUSAP1基因的沉默及过表达;3.NUSAP1结构域质粒及RAD51质粒的转染;4.提取蛋白和蛋白质免疫印迹检测(Western Blotting,WB);5.免疫荧光染色(Immunofluorescencetechnique);6.Cell Counting Kit-8(CCK8)检测细胞增殖;7.免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP);8.统计学分析。结果:1.Western blotting验证表明,NUSAP1敲低组相比较对照组P-CHK2和yH2AX蛋白水平调节上调,而P-ATM,RAD51表达水平下调,DNA损伤反应激活。2.通过COIP实验,过表达NUSAP1组的CLL细胞中RAD51蛋白表达较对照组增强,证明NUSAP1可与RAD51结合发挥作用。3.免疫荧光检测RAD51水平,与对照组相比,NUSAP1表达下调的细胞中,细胞RAD51染色荧光降低,NUSAP1过表达后,RAD51细胞染色增加。NUSAP1主要表达于细胞核,而RAD51主要表达于细胞质。4.COIP检测证明,NUSAP1在内源性和外源性都与RAD51结合,并通过C端结构域与RAD51直接结合。转染缺失SAP域的NUSAP1-δSAP质粒至CLL细胞中,与NUSAP1过表达组相比,NUSAP1-ASAP转染组相较于NUSAP1组RAD51表达降低。5.NUSAP1敲除后,氟达拉宾和伊布替尼处理的细胞存活率较对照组减低(p<0.01)。在药物处理的基础上转染RAD51质粒,MEC-1和EHEB细胞存活率均在48小时后恢复。结论:综上所述,NUSAP1可以通路调节DNA信号通路影响CLL细胞DNA损伤修复水平。干扰NUSAP1基因表达后,CLL细胞DNA损伤水平升高,过表达NUSAP1基因后,CLL细胞的DNA损伤修复水平增高。提示NUSAP1可能是通过CLL细胞的DNA损伤修复促进细胞生长,从而增强其耐药性,从而为寻求新的治疗靶点克服CLL的复发与耐药问题提供理论依据。