NUSAP1调控DNA损伤修复通路在慢性淋巴细胞白血病中的作用及机制研究

来源 :山东大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ya0000000000
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)是西方国家最常见的白血病。据最新SEER统计,其发病率为4.7/100000,男性发病多于女性(约1.9:1),5年生存率约为87.9%。本病常发生于老年患者,诊断中位年龄为70岁,以临床病程多变并容易复发为特征。Del(17p)/TP53突变、NOTCH1突变、CD49d、免疫球蛋白重链可变区基因(Immunoglobin Heavy Chain Variable Region)IGHV 突变状态、复杂核型和 Rai 和Binet分期系统对判断临床预后指导决策具有重要价值。新型药物,包括B细胞受体BCR信号通路抑制剂(ibrutinib、acalabrutinib、idelalisib 和 duvelisib)和抗凋亡蛋白 BCL-2抑制剂(venetoclax),与传统的免疫疗法相比具有优越性。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和异体干细胞移植(allogenetic stem cell transplant,allosct)可以用于高危患者的细胞免疫治疗。近年来研究发现,许多基因异常表达与疾病的进展过程及化疗耐药性有关。因此临床亟待寻求新的治疗靶点克服CLL的复发与耐药问题。核仁纺锤体相关蛋白 1(Nucleolar and spindle associated protein 1,NUSAP1)是一种分子量为55KD的微管结合蛋白,它结合微管并主导有丝分裂进程、纺锤体形成和稳定,是一种在有丝分裂过程中调控正常细胞周期的重要分子。此外,NUSAP1参与了很多癌症的发展、进展和转移。研究发现,在前列腺癌、乳腺癌、口腔鳞状细胞癌和宫颈癌中存在NUSAP1表达异常增加,并与患者不良预后相关。并且NUSAP1被认为是口腔鳞癌、食管鳞癌、宫颈癌、乳腺癌、肝细胞癌和前列腺癌的候选生物标志物。上调NUSAP1 可通过调控 Wnt/β-catenin、Hedgehog、PI3K/AKT、Hippo/yap1 等信号通路促进肿瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进侵袭转移。尽管NUSAP1开始被广泛研究,然而其在CLL中的作用和机制尚不清楚。研究发现,DNA损伤是一种频繁发生的现象,并在癌症发展中起着重要作用。DNA损伤反应缺陷是导致正常细胞获得致癌突变的主要因素。然而,肿瘤发生后,恶性细胞适应各种机制,如修复未经检查的DNA复制造成的DNA损伤,以管理它们的生存。DNA修复过程发生在DNA损伤后的一系列复杂过程,有助于维持基因组的保真度,而癌细胞对临床治疗中放疗或化疗诱导的DNA损伤修复能力将影响治疗效果。CLL细胞的DNA修复,这被认为是一种潜在的耐药机制,限制了化疗的细胞毒性作用。基于这些前提,抑制DNA修复过程最近被认为是一种很有前途的治疗癌症的方法。本研究以NUSAP1在CLL细胞株及临床标本的异常表达为切入点,通过慢病毒转染干预NUSAP1的表达水平,进一步探究NUSAP1在CLL细胞生长中的生物学作用,并深入探讨NUSAP1如何调控DNA损伤修复通路影响CLL细胞耐药的分子机制,为探索CLL治疗的新靶点及改善化疗耐药的治疗策略提供理论依据。第一部分:NUSAP1在慢性淋巴细胞白血病发生发展中的临床意义及生物学功能目的:近期研究表明,NUSAP1在多种癌症中存在异常高表达,并与患者不良预后相关,然而NUSAP1在CLL中的作用与临床意义尚不清楚。本研究旨在检测NUSAP1在CLL细胞株及患者原代细胞中的表达水平,分析与患者临床预后的关系,初步探讨其临床意义。此外,通过RNA测序技术,分析NUSAP1在CLL细胞中富集的细胞生物过程及信号转导通路,预测其生物学作用。从而通过病毒转染技术双向调控NUSAP1表达水平,并在体外实验中进一步验证并探讨NUSAP1对CLL中细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期所产生的影响。材料与方法:1.利用GEO数据库分析CLL患者NUSAP1相关生物学信息;2.病例标本采集;3.人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)提取;4.免疫磁珠分选CD19+B细胞;5.CLL细胞培养;6.RNA提取、逆转录及实时荧光定量聚合酶链式反应;7.提取蛋白和蛋白质免疫印迹检测(Western Blotting,WB);8.慢病毒载体介导的NUSAP1基因的沉默及过表达;9.RNA 测序(RNA-sequencing,RNA-seq)技术;10.Annexin V-PE/7AAD法检测细胞凋亡;11.Cell Counting Kit-8(CCK8)检测细胞增殖;12.PI/Rnase法检测细胞周期;13.CLL异种移植小鼠模型建立;14.统计学分析。结果:1.实时荧光定量PCR和Western Blotting结果显示,与健康志愿者B细胞相比,所纳入的51例CLL病例标本及CLL细胞株(MEC-1、EHEB)中NUSAP1在mRNA和蛋白水平均存在异常高表达(p<0.001)。2.NUSAP1高表达与白细胞计数增加、Binet高级别分期、Rai高风险分期、β 2-微球蛋白升高、IGHV未突变、11q/17p缺失/Tp53突变等不良预后指标相关。在GSE22762数据库中,NUSAP1在mRNA的表达水平与患者总体生存率存在显著性差异(HR=3.15,p<0.05)。3.在RNA测序结果中,KEGG通路富集分析结果显示,NUSAP1在与癌症相关的通路中富集如DNA修复通路、PI3K-AKT信号通路、p53信号通路及细胞周期信号通路等。GO功能富集分析显示,NUSAP1与细胞增殖、细胞周期、刺激反应等生物学过程密切相关。GSEA基因富集分析提示,NUSAP1与DNA复制、错配修复、核苷酸切除修复、碱基切除修复、同源重组、细胞周期等方面相关。4.利用慢病毒转染CLL细胞株双向调控NUSAP1表达,与对照组相比,shNUSAP1组细胞增殖活性明显降低(p<0.01),凋亡细胞显著增多(p<0.01),细胞周期阻滞于G0/G1期(p<0.01)。5.体内实验证明,皮下种植shNUSAP1的细胞的成瘤大小显著低于shControl组(p<0.01)。结论:NUSAP1在CLL病例标本及细胞株中表达异常增高,并与患者不良预后相关。通过RNA测序分析预测,NUSAP1可能通过参与细胞DNA损伤修复、细胞凋亡、周期调控等功能促进CLL的发生与发展。进一步敲减NUSAP1后,CLL细胞的增殖活性降低,凋亡增加,G0/G1期细胞周期阻滞,抑制小鼠皮下成瘤生长。阐明NUSAP1在CLL体内外的生物学功能及作用机制,将为寻找CLL相关的新靶点及改善治疗提供新的理论依据。第二部分:NUSAP1靶向DNA损伤修复通路调节慢性淋巴细胞白血病细胞的耐药性目的:近年来,CLL细胞的DNA修复,这被认为是一种潜在的耐药机制,限制难治性/复发性CLL患者的临床治疗效果。抑制DNA修复过程最近被认为是一种很有前途的治疗癌症的方法。本研究旨通过慢病毒转染技术调控NUSAP1在CLL细胞中的表达,进一步探究NUSAP1对下游细胞信号通路及细胞耐药的影响机制,从而为寻求新的治疗靶点克服CLL的复发与耐药问题提供理论依据。材料和方法:1.CLL细胞系培养;2.慢病毒载体介导的NUSAP1基因的沉默及过表达;3.NUSAP1结构域质粒及RAD51质粒的转染;4.提取蛋白和蛋白质免疫印迹检测(Western Blotting,WB);5.免疫荧光染色(Immunofluorescencetechnique);6.Cell Counting Kit-8(CCK8)检测细胞增殖;7.免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP);8.统计学分析。结果:1.Western blotting验证表明,NUSAP1敲低组相比较对照组P-CHK2和yH2AX蛋白水平调节上调,而P-ATM,RAD51表达水平下调,DNA损伤反应激活。2.通过COIP实验,过表达NUSAP1组的CLL细胞中RAD51蛋白表达较对照组增强,证明NUSAP1可与RAD51结合发挥作用。3.免疫荧光检测RAD51水平,与对照组相比,NUSAP1表达下调的细胞中,细胞RAD51染色荧光降低,NUSAP1过表达后,RAD51细胞染色增加。NUSAP1主要表达于细胞核,而RAD51主要表达于细胞质。4.COIP检测证明,NUSAP1在内源性和外源性都与RAD51结合,并通过C端结构域与RAD51直接结合。转染缺失SAP域的NUSAP1-δSAP质粒至CLL细胞中,与NUSAP1过表达组相比,NUSAP1-ASAP转染组相较于NUSAP1组RAD51表达降低。5.NUSAP1敲除后,氟达拉宾和伊布替尼处理的细胞存活率较对照组减低(p<0.01)。在药物处理的基础上转染RAD51质粒,MEC-1和EHEB细胞存活率均在48小时后恢复。结论:综上所述,NUSAP1可以通路调节DNA信号通路影响CLL细胞DNA损伤修复水平。干扰NUSAP1基因表达后,CLL细胞DNA损伤水平升高,过表达NUSAP1基因后,CLL细胞的DNA损伤修复水平增高。提示NUSAP1可能是通过CLL细胞的DNA损伤修复促进细胞生长,从而增强其耐药性,从而为寻求新的治疗靶点克服CLL的复发与耐药问题提供理论依据。
其他文献
研究背景及目的:妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是一种发生在妊娠期的代谢综合征,它增加了胎盘发育不良的风险。GDM患者常合并低脂联素血症和高水平中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)。脂联素(adiponectin,APN)负向调节中性粒细胞功能,抑制中性粒细胞激活、NADPH氧化酶活化。激活
学位
第一部分一种新合成川芎嗪查尔酮衍生物对HE I-OC1细胞的作用机制目的:HEI-OC1细胞系能表达耳蜗毛细胞和支持细胞的标记物,可代表耳蜗Corti器感觉和支持细胞,是一种广泛用于体外筛选和/或评价药物潜在耳毒性的小鼠听觉细胞系,该细胞系也可用于筛选或评价药物的耳保护特性的实验研究。初步研究结果显示一种新合成的川芎嗪查尔酮衍生物对脑缺血再灌注导致的脑损伤具有保护作用。但是,这种新型川芎嗪查尔酮衍
学位
研究背景上颌窦后鼻孔息肉(Antrochoanal polyp,ACP)是一种特殊类型的鼻息肉(Nasal polyp,NP),其发病率约占NP的4~6%。与NP相较,ACP多单侧发病,且以儿童及青少年较为多见,临床症状也相对较轻。我们的前期研究发现,与NP相比,ACP上皮重塑程度较轻,与非Th2型炎症浸润更为相关,但目前关于ACP的病因及发病机制缺乏深入研究。鼻腔黏液纤毛清除(Mucocilia
学位
青光眼是以视盘萎缩和凹陷、视野缺损和视力损害为特征的一组疾病。据估计,到2020年,全世界约有8000万人患有青光眼。根据虹膜角的情况,青光眼可分为开角型、闭角型和发育型,并进一步分为原发性和继发性。原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)的主要病理变化表现在小梁网细胞的功能下降或丧失,继而引起大量房水积聚,发生高眼压。因此,在眼压升高的POAG中,关
学位
目的:探讨膜联蛋白A1(ANXA1)的N末端肽Ac2-26对高糖刺激的小鼠巨噬细胞极化的影响及其机制。方法:体外培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM),将其分为对照组、高糖组、高糖+Ac2-26组、高糖+Ac2-26+甲酰肽受体2(FPR2)拮抗剂WRW4组和高糖+Ac2-26+磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂wortmannin组。ELISA检测BMDM上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、
期刊
第一部分 儿童IgAN血脂异常与临床及病理特征的关系目的:回顾性分析我院原发性IgAN儿童的临床和病理资料并探讨其与血脂异常之间的关系,为儿童IgAN的临床治疗及预后判断提供一定的科学依据。方法:回顾性收集2016年2月1日至2020年8月31日山东省立医院首次确诊为原发性IgAN患儿的资料。根据是否存在血脂异常进行分组。分析比较两组的临床和病理特征,采用Logistic回归分析IgAN患儿伴有血
学位
目的 探讨临床护士安全输血护理管理现状。方法 采用安全输血护理管理现状调查问卷,按照护士层级分层选取临床科室440名护士进行问卷调查。结果 共纳入400名护士,临床护士的输血管理标化总分为(95.13±5.40)分;输血知识、血液管理、核对管理、人员管理4个维度中得分最高的为核对管理,得分为(98.70±3.52)分,得分最低为人员管理,得分为(87.63±14.70)分;不同性别、职称、工作年限
期刊
研究背景:骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种以骨量下降,骨微结构损坏,导致骨脆性增加,易发生骨折为特征的全身性骨病。随着全球人均寿命延长和社会普遍老龄化,骨质疏松症患病率逐年增高,已成为一个严重威胁人类健康,值得全世界关注的问题。甲状腺功能的改变对骨骼发育生长以及成人骨骼稳态的维护有着众所周知的深远影响。甲状腺功能异常对骨骼的影响一直被归因于循环中甲状腺激素的改变,很少有人注意到同
学位
目的:以小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7为研究对象,体外探讨高糖微环境对小鼠巨噬细胞极化的影响,并阐明miR-125b的调控作用。方法:RAW264.7细胞分为正常对照(NG)组、正糖抑制(NG+miR-125b inhibitor)组、高糖刺激(HG)组和高糖抑制(HG+miR-125b inhibitor)组,进行相应的干预处理。各组细胞体外培养72 h后留取细胞及上清,采用实时荧光定量PC
期刊
自身免疫性脑炎(Autoimmuneencephalitis,AE)是一系列由针对特定抗原的抗体引起的神经系统疾病,临床上表现出一系列严重而复杂的神经精神症状,包括精神行为异常、认知功能障碍、自主神经功能障碍、癫痫发作、意识障碍和中枢性低通气等。其中抗NMDAR脑炎是最常见的自身免疫性脑炎。目前关于AE的发病机制尚不清楚,可由多种病因引起,常见的易感因素是前驱病毒感染(如单纯疱疹病毒性脑炎)、合并
学位