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背景与目的：人口爆炸已成为全球重大问题。在全球范围内，每一年有超过2亿个妊娠发生，而其中50%是意外妊娠。我国是人口大国，计划生育是我们的基本国策，避孕药的研发一直备受关注。杀精剂是用于避孕的药物，在性交前用于阴道以避免妊娠，杀精剂配合其他屏障性避孕措施使用是一种非常有效的避孕措施。目前广泛使用的杀精剂壬苯醇醚-9（nonoxynol-9，N-9）可能增加艾滋病感染可能性，因而亟需研发新的杀精剂。中药是我们的传统药物，是药物研发的宝贵资源库，山东省计划生育科学技术研究所的前期研究从数百种单味中药中已发现桔梗、远志、公丁香具有快速体外杀精子活性，其中桔梗皂苷类提取物的杀精活性最强。有研究显示来自植物的天然皂苷类是一类很有发展前景的体外杀精剂。本研究通过预实验证实桔梗中含量最丰富的一种皂苷-桔梗皂苷D（Platycodin D，PD）具有体外快速杀精子活性，进一步通过与其他数种皂苷单体比较，证实PD的体外杀精活性，并通过精子凋亡检测、低渗肿胀实验、透射及扫描电镜等探索其杀精机制，同时通过DNA损伤实验、体内避孕实验、阴道刺激实验等初步研究其成药可能性，以期望获得具有杀精作用的临床前候选药物。方法和结果：1.伊红染色检测精子活性（远志酸或桔梗皂苷D）1μl+伊红49μl，混匀，取混合液5μl+5μl精液，载玻上混匀，观察精子着色情况。0.25mmol/L桔梗皂苷D（PD）在瞬间杀灭全部精子（<20s），同样条件下，远志酸（Polygalacic acid，PA）杀灭精子所需浓度为7.5mmol/L。PA有效杀精浓度太高被淘汰，0.2mmol/LPD可有效杀灭精子，作为进一步实验的作用浓度。2.计算机辅助精子分析系统（CASA）筛选备选药物并分析目标药物杀精活性将同一健康男性的精液均分为6份，分别用0.9%NaCl对照，1%DMSO，0.2mmol/l远志皂苷B（OnjisaponinB，OB），0.2mmol/L常春藤皂苷B（Hederasaponin B，HB），0.2mmol/L去芹菜糖桔梗皂苷D（Deapio platycodin D，DPD）处理精子2min。用计算机辅助的精液分析系统（CASA）检测备选药物对人精子的杀伤效果。筛选出PD为活性最强的单体，将同一健康男性的精液均分为4份，分别用0.9%NaCl对照，0.15mmol/LPD，0.20mmol/LPD，0.20mg/ml N-9(=0.308mmol/L)阳性对照处理2min。CASA检测0.15mmol/LPD精子活率（a+b+c%）为47.15±12.44，0.20mmol/LPD精子活率21.38±10.69，0.25mmol/LPD精子瞬间完全失活。得出PD最佳杀精浓度是0.20mmol/LPD，用于后继实验。3.杀精机制研究健康男性的精液上游后，用凋亡试剂盒检测PD对人精子的凋亡诱导作用；用低渗肿胀检测试剂盒，LIVE/DEAD Sperm Viability Kit检测PD对人精子细胞膜的完整性及存活状态的影响。结果发现0.20mmol/LPD引起大量精子发生晚期凋亡，精子肿胀率下降，LIVE/DEAD检测发现大量死亡精子；扫描和透射电镜结果显示，精子头颈处断裂，精子膜破裂，线粒体肿胀及膜丢失； CometAssay结果显示0.20mmol/L PD不会对精子DNA造成损伤。3.1精子凋亡检测：0.10mmol/L,0.15mmol/L,0.20mmol/L,0.25mmol/L PD使大量精子发生凋亡，以晚期凋亡和坏死（即FITC+PI+）为主；0.25mmol/L PD晚期凋亡及坏死精子比例占精子总数的75.84±11.12%；各剂量组PD对精子的早期凋亡（FITC+PI-）均没有影响。表明PD破坏了精子膜。3.2低渗肿胀实验：0.9%NaCl对照组多数精子发生了膨胀（尾部卷曲），而PD组精子膨胀不明显，低渗肿胀反应消失，膨胀率从76.5±6.12%下降28.0±6.13%，两组间膨胀率有显著差异。结果显示精子膜受到PD损伤。3.3LIVE/DEAD检测：对照组精子以绿色荧光（活精子）为主，PD处理后橙色荧光（频死精子）、红色荧光（死亡精子）明显增加，阳性对照组（0.2mmol/L N-9）与0.1mmol/L PD组杀精效果相近，0.2mmol/L PD组精子几乎都是红色荧光，杀精率>95%。3.4扫描电镜及透射电镜：在扫描电镜下，对照组精子形态正常，顶体清楚，用药后，可见大量精子头颈处断裂。在透射电镜下，对照组精子细胞膜完整，线粒体结构完整。用药后，精子膜破裂，线粒体肿胀，甚至膜脱落。3.5Comet Assay实验：阴性对照组，PD0.2mmol/L组的所有实验用精子，均没有发现DNA移动尾巴，阳性对照组有明显的DNA移动尾巴。4.动物实验4.1避孕实验：雌性SD大鼠右侧子宫注入0.9%NaCl100μl（对照组），在左侧子宫给予3mg/ml PD100μl(剂量为0.3mg)，术后与雄鼠2:1合笼；第二天发现阴栓后分笼，10天后处死老鼠，发现注射PD侧（左侧）子宫无孕囊，而注射生理盐水侧（右侧）子宫正常妊娠。4.2阴道刺激实验：雌性大鼠随机分为5组，每天定时给予0.2ml（约0.5g)PD凝胶阴道局部给药，连续给药14天，末次给药后处死动物，取出阴道组织，用甲醛固定，进行组织病理学检查及阴道刺激评分[40]。自然对照组，空白凝胶组，3mg/g PD组，8mg/gPD组，8mg/g N-9组的阴道刺激评分分别为2.11±2.01，3.22±1.07，4.89±0.69，7.44±1.58，3.67±1.53。阴道刺激试验评分低于8分，刺激性在可以接受范围内。结论：PD对人精子有显著的瞬间杀灭效应，能引起精子晚期凋亡，杀精机制研究显示PD直接损伤精子膜。杀精浓度的PD对DNA无损伤，大鼠避孕实验证实PD在体内可有效避孕，对阴道刺激性在可接受范围内。PD将来可能作为一种有潜力的临床杀精剂用于避孕。