论文部分内容阅读
猪霍乱沙门菌(Salmonella enterica serovar Choleraesuis,S.Choleraesuis)是一种非伤寒沙门菌,是诱发仔猪副伤寒的主要病原体,给中国的养猪业造成了巨大的经济损失。中国预防S.Choleraesuis最有效的疫苗是C500,C500是通过化学诱变获得的一株遗传稳定、免疫性较好的弱毒株。虽然C500弱毒活疫苗使用以来,我国的仔猪副伤寒得到有效控制,但是该弱毒株仍有较高的残余毒力,且遗传背景不清楚,因此需要对C500进行优化,以获得更安全的减毒活疫苗。通过对C500株测序发现,C500有多个基因缺失或失活,包括asr、ydgF、ydgD、ydgE、rpoS和ptsG;对这些基因进行分析及动物实验发现,rpoS基因的失活是C500主要的减毒方式,这为开发更加安全的猪霍乱疫苗提供了研究基础。本文以C500疫苗株为背景菌株,回复其rpoS基因的活性,使其具备像野生株侵袭细胞的能力;然后再以回复了rpoS基因活性的减毒株为背景株,分别缺失crp、fur、phop、aroA等基因,再从这四株重组减毒株中筛选一株免疫原性较好,副作用小的疫苗株。将该疫苗株作为载体,用于递呈猪链球菌(Streptococcus suis,SS)的蛋白抗原,达到既能预防猪霍乱沙门菌病,又能预防猪链球菌病的目的。1.猪霍乱沙门菌重组减毒株的构建目的:构建免疫效果好,同时副作用小的重组猪霍乱沙门菌疫苗株。方法:首先以猪霍乱沙门菌疫苗株C500为亲本株,通过自杀质粒pRE112介导的同源重组技术,先回复rpoS基因,使其具备像野生型菌株侵入机体并定植体内的能力。通过对C500的全基因组序列分析,我们发现rpoS基因并未完全突变,而是保留了该基因起始的103bp。因此在构建回复rpoS基因的自杀质粒时,我们先以野生型猪霍乱沙门菌C3545为模板,扩增完整的993bp rpoS基因;然后再以C500基因为模板扩增该基因上游的293bp同源臂基因,将二者融合作为回复该基因的上游同源臂。下游同源臂则选取rpoS基因下游350bp序列,最后将上下游同源臂融合,从而构建自杀质粒。在回复rpoS基因突变株的基础上,同样应用自杀质粒介导的同源重组技术,分别引入crp,fur,phop以及aroA等突变。结论:应用自杀质粒介导的同源重组方法成功回复了rpoS基因,并构建了C5001、C5002、C5003、C5004四个重组减毒株。2.突变株生物学特性的研究目的:将本研究构建的猪霍乱沙门菌重组减毒株C5001、C5002、C5003、C5004与疫苗株C500进行多方面的比较,从而筛选出一株在入侵动物机体时能具备像野生型菌株定居宿主淋巴组织的能力,以保持高度的免疫原性,同时副作用较小的疫苗株。方法:首先检测各减毒株在LB液体培养基中的生长曲线,然后检测各减毒株在半固体培养基中的运动型,检测减毒株在小鼠体内的定植以及对小鼠的免疫保护效果。结论:通过对各减毒株的比较,最终筛选出较优疫苗株C5001。3.减毒猪霍乱沙门菌递呈猪链球菌STK、GDH、ccpA蛋白的构建及其免疫原性初探目的:构建C5001载体,然后分别递呈猪链球菌的STK,GDH,ccpA等蛋白抗原,并初步评估二联苗的免疫原性。方法:应用自杀质粒介导的同源重组技术,缺失C5001的asd基因,从而构建平衡致死系统,用于递呈STK,GDH,ccpA等蛋白抗原。将stk、gdh、ccpA基因分别通过酶切连接的方法与表达质粒pYA3493连接,构建pYA3493-stk、pYA3493-gdh、pYA3493-ccpA表达质粒。将各表达质粒分别转入载体C5001,然后检测重组株对于小鼠的保护率。结论:成功构建了重组疫苗株,将疫苗株免疫小鼠,然后用猪链球菌SC19毒株攻毒,小鼠在24小时内全部死亡。