【摘 要】
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核酸作为生命体的重要物质,它在体内的异常存在,往往与所感染病毒或癌症疾病有着密切的关联。想要快速有效地治疗此类疾病,就必须尽早进行体外核酸检测,确定产生异常的核酸,并有针对性的治疗。所以现如今体外核酸快速检测是临床诊断和生物技术应用中的热门领域之一。此外平均每年全球因流感病毒导致严重疾病的人数多达三百万到五百万,流感病毒感染死亡人数高达五千,可见流感对人类有极广泛影响,特别是甲型流感病毒。只有尽快
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核酸作为生命体的重要物质,它在体内的异常存在,往往与所感染病毒或癌症疾病有着密切的关联。想要快速有效地治疗此类疾病,就必须尽早进行体外核酸检测,确定产生异常的核酸,并有针对性的治疗。所以现如今体外核酸快速检测是临床诊断和生物技术应用中的热门领域之一。此外平均每年全球因流感病毒导致严重疾病的人数多达三百万到五百万,流感病毒感染死亡人数高达五千,可见流感对人类有极广泛影响,特别是甲型流感病毒。只有尽快确定致病病毒类型,才能对症治疗,所以提升甲型流感的检测效率是长久功课。近十年来快速崛起的体外核酸快速检测方式,是利用Cas12a、Cas13a等基因编辑酶CRISPR-Cas效应蛋白结合荧光探针或者其他手段进行体外核酸快速检测。但又往往因样本的核酸特别微量,需要一定技术实现核酸快速扩增与检测结果可视化。本人致力于将基因编辑酶LbCas12a荧光检测系统与RPA恒温扩增技术相结合,作为体外核酸快速检测的主体技术,实现对甲型流感病毒临床样品的检测。本论文首先阐述了 LbCas12a附属切割属性偏好特性,以及仅用LbCas12a体系进行荧光检测的特异性与灵敏度。再接着探究结合RPA扩增技术的检测体系,将灵敏度提高了 6个数量级。最终建立了能够检测近乎单拷贝样品的基因编辑酶LbCas12a介导的RPA恒温扩增核酸检测体系,为此后建立更灵敏更高效的体外核酸快速检测体系做好前期基础工作。同时本人还会继续对该体系进行改进与创新,结合更现代化的技术,如侧流层析、直接观察可视荧光、微流控等方法,进而缩短检测时间,提升灵敏度,增加该体系检测效率,降低检测成本,提高运输保存的便捷度。最终实现该体系在体外核酸快速检测上真正的广泛应用。
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