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目的:体外制备CD40单链抗体(CD40 single-chain variable fragment,CD40Sc Fv),探讨CD40Sc Fv通过促进树突状细胞(Dentritic cell,DC)分泌IL-12,进而诱导辅助性T淋巴细胞1型(T helper lymphocytes 1,Th1)的极化,分泌具有抗肿瘤作用的细胞因子,从而发挥抗肿瘤作用,为其进一步应用于临床提供实验依据。方法:1.CD40Sc Fv蛋白的制备:根据本实验室已获得p CANTAB5E-CD40 Sc Fv噬菌粒,引入双酶切位点,PCR扩增目的基因CD40sc Fv,利用双酶切技术构建p ET28a-CD40Sc Fv重组质粒,将重组质粒转化入Rosetta大肠杆菌,IPTG诱导CD40Sc Fv蛋白的表达,蛋白亲和层析纯化蛋白,将纯化的蛋白进行蛋白复性和浓缩,BCA测定蛋白含量,SDS-PAGE和Western blot鉴定所获得的CD40Sc Fv蛋白。2.CD40Sc Fv诱导Th1细胞极化的体内研究:构建负荷小鼠乳腺癌4T1细胞的Balb/C小鼠右腋下肿瘤模型,瘤体注射药物进行治疗,根据治疗药物的不同,将荷瘤小鼠分成3组:CD40Sc Fv组、激动型CD40单克隆抗体组(CD40monoclonal antibody,CD40m Ab)和NS组,观察各组小鼠肿瘤体积的变化。给予不同治疗后,处死小鼠取瘤体组织,ELISA检测肿瘤组织上清中IL-12的浓度,通过酶消化法提取肿瘤组织浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes,TILs),应用流式细胞技术检测TILs中Th1与Th2的细胞比例。3.CD40Sc Fv诱导Th1细胞极化的体外研究:体外诱导培养DC,肿瘤冻融抗原致敏DC,根据DC激活的条件不同,分为3组:CD40Sc Fv组、TNF-α阳性对照组和PBS对照组,用流式细胞仪检测各组DC表面分子的表达情况,ELISA检测DC培养液上清中IL-12的浓度,免疫磁珠法从小鼠脾脏中分选CD4+T淋巴细胞,将各组DC与CD4+T淋巴细胞共培养,应用流式细胞技术检测共培养液中Th1与Th2的细胞比例。结果:1.构建的p ET28a-CD40Sc Fv重组质粒,经基因测序鉴定所插入的序列大小和方向正确,IPTG诱导大肠杆菌表达的CD40Sc Fv蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达成功,分子大小为27KDa左右,经镍柱纯化后蛋白经BCA测定浓度为1.12mg/ml。2.CD40Sc Fv组肿瘤组织上清中IL-12的浓度为(396.27±48.13)pg/m L,显著高于NS组,差异具有统计学意义(P<0.05),而与激动型CD40m Ab组相比无明显差异(P>0.05);CD40Sc Fv组小鼠肿瘤微环境中的Th1/Th2细胞比值为(6.32±0.87),显著高于NS组,差异具有统计学意义(P<0.05),而与激动型CD40m Ab组相比无明显差异(P>0.05)。3.CD40Sv Fv组DC表面标志物的表达率分别为CD80(91.5±3.2)%、CD86(85.1±3.7)%、MHC-Ⅱ(90.6±4.4)%,显著高于PBS对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而与TNF-α阳性对照组相比无明显差异(P>0.05);CD40Sc Fv组培养液上清中IL-12浓度为(674.37±73.59)pg/m L,显著高于PBS对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而与TNF-α阳性对照组相比无明显差异(P>0.05);CD40Sc Fv实验组的Th1/Th2细胞比值为(9.98±1.78),显著高于PBS对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而与TNF-α阳性对照组相比无明显差异(P>0.05)。结论:1.成功构建携带CD40ScFv的pET28a-CD40ScFv重组质粒。2.重组质粒转化入Rosetta菌后经IPTG诱导后可以稳定表达有功能的CD40Sc Fv蛋白。3.CD40Sc Fv在体内可以通过改变肿瘤微环境中Th1/Th2细胞的状态,发挥抑制肿瘤生长的作用。4.CD40Sc Fv在体外通过促进DC的活化与成熟,分泌更多的IL-12,进而诱导Th1细胞的极化。