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CRISPR/Cas9系统是一种新型基因组靶向编辑技术。在这个系统中,通过一段小RNA的引导作用,实现对靶基因的定点切割。相对于之前的ZFN和TALEN系统,这种新型的基因组编辑技术具有操作简便、成本低、效率高及可同时靶向多个基因等优点。在CRISPR/Cas9系统中,具有结合与切割功能的Cas9蛋白的核酸酶区域由两部分组成(HNH 与 RuvC),RuvC 与 HNH 可分别对引导 RNA(Guiding RNA,gRNA)相对应的DNA互补链与非互补链进行切割。Cas9蛋白的D10A与H840A突变可分别导致RuvC与HNH结构域的失活,产生失去切割活性的Cas9蛋白(catalytically dead Cas9 mutant,dCas9)。已有研究表明,在D10A与H840A突变的基础上再经过D839A、N863A两个氨基酸的突变所生成的Cas9m4蛋白与dCas9蛋白相比,具有更好的基因组结合活性和更低的脱靶效率。通过使用柔性连接肽将Cas9m4蛋白与具有转录激活功能的VP64或具有DNA去甲基化功能的TET1-CD连接为融合蛋白,然后结合所设计好的sgRNA,就可以建立基于CRISPR/Cas9的转录因子激活系统或CRISPR/Cas9介导的DNA去甲基化激活系统。iPS细胞技术在生物学与医学上都具有十分重要的意义,尽管在过去的科研中,iPS细胞研究取得了显著的进展,但依然还有很多问题亟待解决。虽然众多科学家在不断地改进iPS细胞的诱导策略,如从整合型病毒载体到非整合型载体的使用,再到质粒和蛋白的应用,其安全性得到不断地加强;此外,小分子化合物、miRNA、缺氧条件等的应用使诱导的效率也在不断提高。但是到目前为止,想要将iPS细胞技术安全地应用于临床依然缺乏高效、安全的iPS细胞诱导技术。本课题尝试用CRISPR/Cas9系统构建转录因子激活系统及DNA去甲基化激活系统,并将之直接用于提高细胞内源性Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个基因的激活表达,为iPS的诱导提供一种新方法。本论文取得了以下研究结果:(1)成功构建了 pCMV-Cas9m4-VP64-Flag 与 pCMV-Cas9m4-TET1-CD-Flag两种融合蛋白表达载体,并验证了两种融合蛋白在真核细胞中的表达。(2)设计了靶向Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个基因的转录激活sgRNAs,并用T7E1酶切的方法检测了 sgRNA的活性。(3)以Oct4基因的转录起始区域为靶位点,采用亚硫酸氢盐测序法分析了DNA去甲基化激活系统对靶位点DNA的甲基化水平的影响,研究结果表明CRISPR/Cas9介导的DNA去甲基化激活系统可以有效降低靶位点DNA的甲基化程度。(4)采用实时荧光定量PCR方法检测了两种激活系统对四种靶基因的表达水平的影响。研究发现,CRISPR/Cas9介导的转录因子激活系统对四种靶基因的转录激活都具有明显的促进作用;CRISPR/Cas9介导的DNA去甲基化激活系统对四种靶基因的激活转录作用的效果低于CRISPR/Cas9介导的转录因子激活系统,并且对于四种靶基因的转录激活存在一定的差异。综上所述,本研究成功地建立了两种CRISPR/Cas9介导的转录激活系统,分别是基于CRISPR/Cas9的转录因子激活系统与CRISPR/Cas9介导的DNA去甲基化激活系统;两种转录激活系统可以在不同程度上提高细胞内源性Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个基因的表达。该研究为探索iPS的诱导方法提供了新的思路,同时也为其他基因转录调控研究提供了一种经济便捷的研究工具。