两种植物精油对洋葱软腐病菌的抑菌机理及其抑制研究

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软腐病是易发于洋葱上的一种细菌性病害,主要病原菌为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,简称P.carotovorum)。P.carotovorum具有强致病性,可侵染洋葱组织,导致叶鞘部软化、倒伏,鳞茎腐烂。据统计,在甘肃省由P.carotovorum造成的洋葱软腐病田间发病率可达40~50%,减产30%以上。牛至油和丁香油作为常见的植物精油,具有较强的抑菌活性,但二者对由P.carotovorum引起的洋葱软腐病防治鲜有报道。本研究以P.carotovorum为供试菌株,通过观察处理前后菌体形态的变化,分析精油对细胞膜、电导率和细胞膜电位的影响;检测在精油作用下致病因子的变化,并从分子调控方面分析了致病因子的作用机理;最后用洋葱幼苗试验评估精油对洋葱软腐病的防效。主要内容如下:(1)利用GC/MS分析出牛至油的主要成分为香芹酚(C10H14)占比达到77.65%。丁香油的主要成分为丁香酚(C10H1202)占比65.66%。牛至油对P.carotovorum的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)均为200μL/L,丁香油的MIC和MBC分别为400μL/L和500μL/L。两种精油对P.carotovorum均表现出良好的抑菌效果。采用扫描电镜(SEM)观察到精油作用后,菌体出现皱缩、变形和断裂。同时碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色观察到细胞膜完整性遭到破坏。继而测定了相对电导率和细胞膜电位等指标的变化,结果表明牛至油和丁香油改变P.carotovorum细胞膜的通透性和降低细胞膜电位,导致菌体生长受到抑制或死亡。(2)牛至油和丁香油能抑制P.carotovorum的运动能力,在Swimming试验中,1×MIC精油处理时,能够完全抑制鞭毛运动,Swarming处理时,1/2×MIC牛至油和1×MIC丁香油100%抑制菌落扩散。通过生物膜的初始附着抑制试验表明牛至油和丁香油抑制生物膜的初始形成。在1×和2×MIC时,牛至油生物膜形成抑制率分别为40.49%和17.56%。菌落数为4.85 log(CFU/平板)和3.77 log(CFU/平板);丁香油生物膜形成抑制率为56.49%和31.38%,菌落数为5.38 log(CFU/平板)和4.02 log(CFU/平板)。此外,精油抑制胞外水解酶的分泌,其中,1/2×MIC牛至油对蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和脂肪酶的分泌较对照组分别降低了83.18%、70.79%、5.66%、48.28%和48.68%。丁香油组分别降低了44.66%、70.05%、30.04%、47.37%和73.42%。实时荧光定量PCR结果表明,精油可抑制病原菌致病因子的基因表达,以此降低致病力。(3)在对洋葱软腐病的防效测定中发现,牛至油和丁香油能有效抑制洋葱软腐病的病斑大小。在治疗组中,1×MIC牛至油病斑直径为2.33 mm,抑制率为92.29%,丁香油病斑直径为3.83 mm,抑制率为87.08%。预防组中,1×MIC牛至油病斑直径为0.22 mm,抑制率达到99.28%,丁香油为2.94 mm,抑制率为89.94%。2×MIC浓度的精油对软腐病的防效均达到98%以上。盆栽试验表明,1×MIC牛至油预防组的防效为74.07%,治疗组的防效为67.23%,1×MIC丁香油的预防组和治疗组的防效分别为63.80%和63.39%。2×MIC浓度精油的防效均在80%以上。并且精油处理后均提高了洋葱幼苗体内过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性,从而提高了洋葱的抗病能力。因此,牛至油和丁香油减少软腐病的病斑大小可能是直接抑菌和抑制致病因子作用以及提高洋葱体内POD酶活性相互协同作用的结果。
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