异丁醇作为新一代生物燃料,与传统生物燃料乙醇相比,具有能量密度高、挥发性小、吸湿性低、辛烷值高等优点。异丁醇还可与石油、汽油以任意比混溶,再加上其生产工艺与乙醇相似,现有的乙醇生产设施经过稍微改造便可以生产异丁醇,因此异丁醇的市场潜力较为巨大。能代谢产异丁醇的微生物有许多,但只有酿酒酵母本身具有合成异丁醇的优势基因,能在自然条件下利用自身缬氨酸代谢实现异丁醇的生物合成;并且对异丁醇毒性的耐受高达20 g/L及以上;再加上酿酒酵母可以利用木质纤维素发酵产异丁醇,可大大降低发酵成本,使其成为研究高产异丁醇的首选菌株。利用生物合成法发酵生产可再生能源异丁醇,是目前市场及研究者都极为重视的方法。本工作以酿酒酵母W303–1A(实验室保藏)为原始菌株,利用基因工程以及分子生物学知识构建高产异丁醇菌株。主要工作有如下几方面:第一,基因GPD1、GPD2和LPD1的质粒的构建;第二,利用一步基因置换法缺失基因GPD2和GPD1以降低副产物甘油的合成;第三,利用一步基因置换法缺失基因PDC6以降低乙醇的合成;第四,过量表达编码乙酰乳酸合酶的ILV2基因,并在线粒体里过量表达编码酮异戊酸脱氢酶的ARO10基因;第五,对ILV2基因和ARO10基因表达量做RT-PCR验证;第六,检测所构建工程菌的发酵性能。工程菌HZAL–13(PGK1p–BAT2 gpd2Δ::RYUR)是在实验室前期工作基础上在菌株HZAL–2中缺失GPD2基因得到;工程菌HZAL–14(PGK1p–BAT2 pdc6Δ::R gpd2Δ::RYUR)是在HZAL–13基础上缺失PDC6基因得到;工程菌HZAl–18(PGK1p–BAT2 pdc6::RΔgpd2Δ::R gpd1Δ::RYUR)是在HZAL–7基础上缺失GPD1基因得到;W303–1A(PGK1p–ILV2 PGK1p–ARO10)是在W303–1A里过表达基因ILV2和ARO10得到的。本工作研究结果表明:对照菌株W303–1A,工程菌HZAL–13 pILV2以及工程菌HZAL–14 pILV2,异丁醇最大产量分别为0.0298 g/L,0.1623 g/L和0.3093g/L。工程菌HZAL–13 pILV2的异丁醇产量比对照菌株增加4.45倍;工程菌HZAL–14 pILV2,异丁醇产量较对照菌株增加9.38倍;工程菌W303–1A pILV2pARO10的异丁醇产量最大值达到0.1193 g/L,其产量较对照菌株增加2.87倍。综上所述,过表达酿酒酵母缬氨酸途径关键基因以及减少副产物甘油和乙醇的生物合成有助于提高异丁醇的产量。利用酶的定向区域化分布原理,将酮异戊酸脱氢酶Aro10在线粒体里表达也可显著提高异丁醇产量。