论文部分内容阅读
目的:分别通过体内和体外实验研究证明桂皮醛(cinnamaldehyde,CA)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)形成生物膜的抑制作用；并检测桂皮醛对MRSA生物膜形成关键基因sarA以及体内试验动物血清中炎症因子IL-1β的影响,为进一步探讨桂皮醛的作用机制奠定基础。
方法:
1.将实验菌株(包括6株MRSA和1株标准菌株ATCC25923)接种L-B琼脂平板,37℃培养24h,然后行K-B法和微量琼脂稀释法药敏试验,测得抑菌环直径,最低抑菌浓度(minimum inhibitoryconcentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidalconcentration,MBC)；
2.利用96孔板法构建MRSA生物膜,分别加入不同浓度的药物(包括0.5×,1×,2.5×和5×MIC),作用24h后分别采用MTT法和菌落计数法测定生物膜内细菌数量的变化；
3.分别采用扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜对上述桂皮醛对MRSA生物膜的作用加以验证；
4.利用PCR方法检测各待测菌株内有无icaA和sarA两种基因；
5.不同浓度的桂皮醛作用MRSA生物膜24h后,提取细菌细胞总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测用药前后sarAmRNA水平的变化；
6.在体内,采用皮下羧甲基纤维素钠(CMC)-囊袋法制备MRSA在SD大鼠体内的生物膜模型,并给模型大鼠分别连续腹腔注射桂皮醛(cinnamaldehyde,CA)30、45、60(mg／(kg.d))4d,同时设生理盐水对照组和生物膜模型组；
7.在给药后的第1d、3d、5d采集菌液进行菌落计数,末次给药后24h断头取血,收集病变组织,进行病理切片观察；用RT-PCR检测血中IL-1βmRNA的变化；用酶联免疫法测定血清中IL-1β含量的变化。
结果:
1.从K-B法药敏试验结果可以看出:抑菌环直径随加药浓度的增大而增大。当加药浓度为4％(v／v)时,各测试菌株的抑菌环直径均≥26mm,达到了药敏试验敏感的范围；微量琼脂稀释法测得各待测菌株的MIC和MBC值的范围分别为0.0625％-0.125％(v／v)和0.25％-0.5％(v／v)；
2.96孔板法成功制备MRSA生物膜；加入不同浓度药物后,MTT法和菌落计数法测得的结果一致,即随加药浓度的增大,生物膜内菌落数量减少；
3.扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜下分别观察到桂皮醛对MRSA形成生物膜的破坏作用,且随加药浓度的增大,生物膜结构破坏越大,膜内菌落数越少；
4.PCR结果显示各测试菌株均无icaA基因,而含有sara基因；
5.除菌株JB-06外,其他测试菌株在加入0.5×MIC浓度桂皮醛药液后sarA基因mRNA水平降低；
6.SD大鼠皮下注入金黄色葡萄球菌菌液4天后形成皮下CMC-囊袋生物膜模型；
7.SD大鼠腹腔注射不同浓度桂皮醛药液后1d,3d和5d分别进行菌落计数,发现随时间延长菌落数减少；病理组织切片观察到炎症随加药时间延长有愈合倾向；血中IL-1βmRNA水平在加药后减低,ELISA法测得血中IL-1β含量随加药浓度增大而减少。
结论:
本研究通过体外和体内试验分别证实了桂皮醛对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌形成生物膜的抑制作用；并且通过扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜加以证实；桂皮醛能下调金黄色葡萄球菌生物膜形成关键基因sarA的表达；并且在体内通过调节血清中炎症因子IL-1β的变化来促进炎症的愈合。