近年来,药物经呼吸道给药作为重要的非侵入性给药系统具有明显的优势,受到研究者很高的重视。然而,众所周知的是,和传统的注射给药比较起来,包括蛋白质和肽类药物在内的疏水性及大分子药物经呼吸道系统给药后的吸收仍然明显偏低。他们相对较低的生物利用度主要归因于大分子药物呼吸道黏膜的透过性较低和药物在吸收过程中极易被降解这两点主要原因。因此,本课题拟采用以树枝状聚酰胺-胺(PAMAM dendrimer)作为潜在的吸收促进剂,用体内、体外双模型来考察PAMAM dendrimer对难吸收药物经呼吸道给药系统的吸收促进作用,并进一步用体外实验证明PAMAM dendrimer吸收促进作用的机制,最终找到一个合格的、安全有效的、作用机制明确的经呼吸道给药系统的吸收促进剂,将DNA微阵列芯片技术引入到PAMAM dendrimer透膜机制的研究中,使研究涉及动物、细胞、分子三个水平以寻求一个高效低毒、应用广泛、作用机制明确的吸收促进剂为其将来作为制剂辅料在临床上应用提供科学依据。具体研究内容及方法如下:1.Calu-3细胞模型的建立。采用体外细胞培养法建立细胞模型,倒置显微镜观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,测量TEER值考察细胞完整性,荧光素检查考察细胞通透性。实验结果表明,本研究所培养的细胞形态正常,实验过程中细胞TEER大于500Ω,细胞完整性良好,荧光素的Papp值小于1×10-6cm·s-1,细胞通透性良好。在本实验的条件下,培养细胞的方法快速、可靠、简便。2.PAMAM dendrimer体外毒性的评价。实验中采用 MTT法确定PAMAM dendrimer的给药浓度,体外培养Calu-3细胞,分别用3种浓度的PAMAM dendrimer处理细胞,以沉积在细胞中的水不溶性蓝紫色结晶甲瓒的吸光度值为检测指标,观察Calu-3细胞的存活情况,分别设阴性对照组,阳性对照组和调零组。实验结果表明,0.1%(w/v)G3代PAMAM dendrimer处理过的Calu-3细胞的存活率为90.97±3.98%,与阳性对照组相比,没有明显的影响,因此本研究采用0.1%(w/v)G3代PAMAM dendrimer的浓度作为给药的适宜浓度。3.PAMAM dendrimer对FD4体外转运的影响。采用Calu-3体外模型,用 Hank’s溶液作为转运媒介进行FD4转运实验,对是否加入PAMAM dendrimer和有无有机阳离子转运蛋白抑制剂等分别进行考察,计算Papp值。结果表明,加入PAMAM dendrimer后对Calu-3细胞中FD4的吸收促进率为3.06倍;加入有机阳离子转运蛋白抑制剂后,FD4的转运率被显著抑制。4.PAMAM dendrimer对FD4体内吸收的影响。以SD雄性大鼠为实验动物模型,随机分为 2组,采用气管喷雾给药法在肺部给予含有0.1%(w/v)G3代PAMAM dendrimer的难吸收药物FD4溶液,给药后的不同时间点从大鼠颈静脉取血,采用甲醇沉淀血浆蛋白的方法,利用酶标仪测不同时间点FD4的OD值,绘制标准曲线,计算血药浓度。结果表明:0.1%(w/v)G3代PAMAM dendrimer对FD4有比较明显的促进作用,促进比率为为2.0倍。5.DNA微阵列芯片的研究。采用DNA微阵列技术,研究与吸收相关的转运基因家族的表达。以 Calu-3 细胞为吸收模型,考察 PAMAM dendrimer和模型药物作用后对相关转运蛋白的影响,找到相关的表达基因。结果统计,有26个SLC家族的有机阳离子转运蛋白(OCTs)发生了明显的变化,其中22个基因上调,4个基因下调,也就是说有机阳离子转运蛋白参与到PAMAM dendrimer的跨膜转运中。PAMAM dendrimer表面存在氨基基团,这是PAMAM dendrimer独特的理化性质。我们猜想,氨基基团可能与细胞膜表面的阳离子转运蛋白结合,进而帮助模型药物跨膜转运,最终达到促进其吸收的目的。6.PAMAM dendrimer作用机制的研究。本课题拟采用蛋白印迹(Western blot)和聚合酶链式反应(PCR)对PAMAM dendrimer的作用机制进行进一步的验证。实验结果表明,经过两种方法的验证,PAMAM dendrimer组与空白组比较,有机阳离子转运蛋白OCT1、OCT2、OCT3的表达量明显增加,这与基因芯片的结果相符,说明PAMAM dendrimer促使有机阳离子的表达增加,从而促进药物的吸收。